《The Journal of Wildlife Management》：Long-term seroepidemiology of European brown hare syndrome in European and Italian hares in Tuscany (Italy)
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欧洲棕色野兔综合征（EBHS）是一种由杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）病毒（EBHSV–Lagovirus GII.1）引起的高度接触性传染病。该病于1988年在意大利首次发现，此后已扩散并呈地方性流行，影响兔科多个物种。
欧洲棕色野兔综合征（EBHS）是一种由杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）病毒（EBHSV–Lagovirus GII.1）引起的高度接触性传染病。该病于1988年在意大利首次发现，此后已扩散并呈地方性流行，影响兔科多个物种。值得注意的是，该病已波及欧洲野兔（Lepus europaeus），这是意大利北部和中部的常见物种，以及意大利野兔（Lepus corsicanus），这是意大利中部和南部特有的受保护物种。本研究旨在通过2003年至2019年开展的纵向调查，确定EBHS在格罗塞托省（托斯卡纳，意大利中部）的存在情况并评估其发生率。研究人员采用竞争性酶联免疫吸附试验（cELISA）对479只欧洲野兔和58只意大利野兔的血液样本进行了诊断调查，这些野兔被捕获并释放以补充狩猎区。研究人员按年龄组、性别、物种、采样年份和捕获地点的设施类型分层，确定了抗EBHSV阳性滴度的分布。结果显示，该病在欧洲野兔中的流行程度明显高于意大利野兔。研究人员发现成年个体的阳性率高于幼年个体，雌雄之间无差异。大多数血清抗体滴度较低，表明EBHSV呈地方性流行且种群内保护水平较高。研究人员使用具有二项分布和对数连接函数的广义线性模型（GLM）估计EBHS流行率，包含5个固定效应（性别、年龄、采样年份、采样月份和狩猎区）。性别效应不显著，而年龄效应影响感染概率，成年个体高于幼年个体。冬季月份（1月、2月和3月）EBHSV感染概率较高。年份效应未显示明确趋势，可能与实验设计不平衡有关。这项跨越15年以上的调查数据有助于更好地理解EBHS在地方性流行区的动态，并可为干预策略和改善狩猎区管理提供依据。
**研究背景**
自20世纪90年代以来，野生动物健康及传染病预防与管理日益受到关注。保障野生物种的健康与安全不仅对物种生存和种群平衡的维持至关重要，而且因为野生动物可作为病原体的储存宿主、溢出宿主或易感宿主，在向家养物种甚至人类的传播中发挥关键作用。因此，预防、早期发现疫情、审慎的管理行动以及控制机构与操作人员之间的有效沟通是避免严重后果的基本步骤。
欧洲棕色野兔综合征（EBHS）自20世纪80年代中期以来一直影响欧洲野兔（Lepus europaeus）。最初被认为是一种中毒-代谢综合征，后来被确认为病毒性疾病。在意大利，20世纪80年代中期首次报告的野兔大规模突然死亡事件表明，EBHS是通过频繁的动物转运和释放外来动物以补充狩猎区而引入的。此后，EBHS被认为是欧洲野兔种群下降的原因之一，目前在欧洲已呈地方性流行。此外，EBHSV已被证明可感染其他兔属物种，包括意大利野兔（Lepus corsicanus），但不感染沙丁尼亚野兔或伊比利亚野兔。
EBHSV是一种单链RNA病毒，分类于杯状病毒科兔病毒属，该属还包括引起兔出血症病的另外两种致病病毒（RHDV和RHDV2）。根据基于基因组组织的命名法，RHDV现称为GI.1，RHDV2为GI.2，EBHSV为GII.1。EBHSV可直接通过接触感染野兔传播，也可间接传播（如通过设备和衣物），主要经粪-口和呼吸道途径传播。人类、苍蝇、鸟类和哺乳动物可作为机械载体。EBHS以高发病率（可达100%）和高死亡率（40%–60%）为特征，10%–30%的野兔表现为亚急性或慢性临床过程。虽然各年龄段的野兔均可被感染，但2–3月龄以下的动物感染为亚临床型，不表现临床症状或死亡，但产生抗体。因此，死亡率主要在秋季观察到，此时种群密度较高且当年出生的个体均易感。
根据国际自然保护联盟（IUCN），欧洲野兔保护状况良好，列为无危物种。在意大利，该物种分布广泛并根据国家法律可被狩猎。意大利野兔是意大利中部和南部特有的物种，被IUCN列为易危物种，受意大利1992年第157号国家法律保护。意大利野兔的分布仍然碎片化，以个体数量较少的孤立亚种群为特征。在托斯卡纳，格罗塞托附近的马雷马地区和Poggi di Prata的社区重要地点存在小亚种群。
这两个物种共存的问题可能源于意大利大部分地区为狩猎目的持续大规模释放欧洲野兔。两种物种可在同域情况下共存，尽管两种物种个体之间的直接物理互动罕见。意大利野兔似乎已通过利用更高海拔环境来适应。这种生态位分离显著减少了种间竞争，有利于体型更大、更具攻击性且繁殖率更高的欧洲野兔。因此，欧洲野兔在意大利的广泛存在可被视为意大利野兔栖息地碎片化的原因之一，进一步威胁该物种的保护状况。此外，人类活动、栖息地退化和疾病传播（包括EBHS）可造成严重的管理问题并对种群的自然动态产生负面影响。
鉴于意大利野兔种群规模小以及格罗塞托省对欧洲野兔的密集狩猎和野生动物管理，研究人员认为有必要对两种野兔实施健康监测，特别关注意大利野兔。鉴于EBHS对野兔种群动态的潜在影响，本研究的主要目的是通过分析在捕获和释放个体以补充公共狩猎区期间采集的血液样本，验证格罗塞托省2个狩猎区（ATC）中该病的存在情况。研究数据覆盖2003年至2019年，该时间段足以提供该省EBHS的现实图景。
**关键技术方法**
研究人员于2003年至2019年（2009年除外）每年采集欧洲野兔和意大利野兔的血液样本，作为健康监测的一部分。在每个保护区内使用夜间驾车样线法进行野兔普查，捕获约30%的野兔。捕获后立即从耳静脉采集血样，同时记录性别、体重和年龄（采用Stroh法分为幼年和成年）。血清样本冷冻后送至WOAH兔出血症参考实验室（IZSLER，布雷西亚），采用竞争性酶联免疫吸附试验（cELISA）检测EBHSV特异性抗体。研究人员使用R软件进行描述性统计，并采用二项分布和对数连接函数的广义线性模型（GLM）估计EBHS流行率，考虑性别、年龄、年份、捕获月份和区域的影响。模型拟合通过AIC值比较评估，使用Type II似然比检验评估模型项的显著性。
**研究结果**
**采样**：调查期间共捕获762只野兔，其中581只（76.2%）被采样。应用纳入标准后，537份样本纳入进一步分析。其中479只（89.2%）为欧洲野兔，仅58只（10.8%）为意大利野兔。ATC GR6捕获306只（57.0%），ATC GR7捕获231只（43.0%）。
**血清学分析**：347只（64.6%）野兔抗体阳性，190只（35.4%）阴性。欧洲野兔阳性率为68.9%，而意大利野兔多数为阴性（70.7%）。在阳性野兔中，17份样本（4.9%）具有高滴度，70份（19.9%）为中等滴度，261份（75.2%）为低滴度。大多数地区以1/10–1/40滴度类最为广泛分布，表明抗体水平低，是病毒循环而非流行性疾病的标志。中等和高抗体类最广泛的地区是CPPS Montalto，这可能归因于此前EBHS疫情后使用自体疫苗接种的繁殖野兔的持续存在。雌性阳性率为62.3%，雄性为66.8%。幼年阳性率为47.9%，成年为69.3%。在几乎所有年份中，低抗体类占主导。2017年最高抗体水平类占强势主导，表明EBHSV可能近期循环。
**统计分析**：在GLM中，年龄（P=0.002）、月份（P<0.001）和年份（P<0.001）对EBHS感染状态有统计学显著影响，而性别和狩猎区与疾病发生无显著关联。成年个体感染概率（82%）高于幼年个体（68%）。冬季月份（1月、2月、3月）检测到疾病的概率（>75%）高于10月至12月。2007年和2019年阳性概率最高（约98%），其次为2003年、2016年和2017年（至少80%）。
**讨论与结论**
这项纵向研究结果表明，EBHS在格罗塞托省采样区域内持续存在并广泛分布。采样期间（2003–2019年）的平均阳性率约为65%。欧洲野兔阳性率接近70%，而意大利野兔约30%。这些血清阳性率值与其他研究报道相近。由于野生动物采样难以实现平衡的实验设计，但数据确认了高密度地区显示高血清阳性率的趋势。
当EBHSV进入未感染种群时，通常引起以显著死亡高峰为特征的疫情。然而，EBHS倾向于变为地方性流行，得益于幸存者（近半数恢复的成年个体和所有2–3月龄以下幼年个体）经历隐性感染并获得终身免疫。在地方性流行区，通常观察到稳定的野兔种群，大多数野兔免疫，死亡率低。根据模型，死亡率取决于野兔种群密度，当密度低（<7只/km2）时可能很高。通过密度控制机制维持地方性循环病毒水平是降低EBHS影响的最佳策略。
EBHS是导致意大利和欧洲欧洲野兔种群下降的主要疾病之一，这种下降也与狩猎活动有关。狩猎不仅大幅降低自由狩猎区的野兔密度并有利于EBHS病例的发生，而且由于欧洲野兔是持续移动、引入和补充的物种，疾病随个体从一个野生动物区转移到另一个区域并不罕见。狩猎管理基于全省持续年度补充，特别是从各野生动物区（AFV除外）转运野兔，这些区域代表欧洲野兔的储存库。此类转运，尤其是当被移动动物的健康状况不明时，应被视为有风险的。
确保动物免疫力是一种预防形式，可降低EBHS病例风险。在几乎所有考虑的野生动物区中，最低抗体滴度类（1/10–1/40）最具代表性。这些抗体水平表明先前的EBHSV感染（数月前）或已保护动物对后续接触感染病毒的加强应答。此外，考虑到非致病性野兔杯状病毒（HaCV Lagovirus GII.2）在圈养和自由生活野兔中的广泛存在，不能排除低滴度也可能源于对此类病原体的应答。
按年龄组，幼年个体的预测感染概率显著低于成年个体。因此，年龄可能是影响EBHSV传播的重要因素。首先，幼兔受到母体血清阳性通过胎盘抗体转移和乳汁传递的被动免疫保护；其次，2–3月龄以下对疾病不易感。基于这种幼年抵抗力，旨在实现高种群密度的管理系统在地方性流行区促进病毒传播。
根据文献报道，疾病过程遵循一定的季节性，感染最多的月份为10月至3月。几种假说解释EBHS的季节性发生：1）与繁殖暂停期重合，导致代谢疲劳状态；2）记录到因当年出生的亚成体存在而出现的高人口峰值，这些个体对疾病易感；3）通常与狩猎季节重合，因此有更大的 territorio 监测和更多尸体可供分析。此外，在此期间，由于食物供应减少，野兔营养状况较差，恶劣气候有利于病毒在环境中的存活和传播。在本研究中，疾病的季节性遵循相似模式，但缺乏平衡的实验设计可能影响了数据分布。
采样年份间抗体滴度的时间趋势表明疾病检测概率多变，未揭示典型或周期性模式。因此，疾病高峰可能不仅取决于种群动态（密度和结构），还取决于外部因素，包括气候趋势。高温和极端干旱被认为会减少野兔种群规模并有利于病毒传播。
意大利野兔在整个采样期间的平均阳性率较低（约30%）。文献中关于该主题的研究很少。1998年在西西里岛，18.8%的采样个体检测为EBHS阳性。2023年1月在拉齐奥Castelporziano庄园诊断出意大利野兔EBHS阳性病例。尽管样本数量有限且无法实施平衡的实验设计，这些发现可能与该物种在领土上的低密度有关。另一个假说与意大利野兔在同域地区与欧洲野兔的生态分离有关。种间竞争可能有利于意大利野兔占据更高海拔和更孤立栖息地，这种栖息地分离可能减少与感染欧洲野兔或污染环境的接触频率，从而限制EBHSV传播机会。此外，不能排除意大利野兔对EBHSV具有不同的遗传易感性。
格罗塞托省野兔EBHSV存在监测结果与欧洲其他类似研究关于EBHSV扩散动态的发现一致。然而，本研究报道了一个此前从未被考虑的区域的结果，其中意大利野兔——IUCN认为濒危的物种——在意大利中部和南部某些地区为特有物种。尽管数据收集无法遵循平衡的实验设计，但获得了关于研究区域EBHS存在的原始数据和新信息。关于意大利野兔的数据非常有限，但提供了一些重要信息：与欧洲野兔相比感染较少，可能是种群规模极小的后果，使其在面对假设的持续性EBHS疫情时变得脆弱。
**管理建议**：鉴于所获结果，建议维持和加强健康监测及数据收集活动，尽可能通过全年更平衡的采样，既在各野生动物研究所内（这些是引入周围地区的猎物储存库），也通过狩猎季节被动监测收集的样本，从而增加监测的数值强度和范围。使用血清学进行抗体滴度测定将建立EBHSV感染的时间趋势，从而估计易感种群中新暴露的潜在风险，并实施缓解和控制措施。基本上，应通过促进高种群密度来维持良好、一致的种群免疫力，这允许更大的病毒循环，特别是促进幼年个体及时的主动感染而无疾病或死亡，使其获得终身抵抗力。此外，除上述一般措施外，必须特别注意通过重建自我维持种群和重新引入已发生局部灭绝的地区，为意大利野兔的恢复和种群增长创造有利条件。
**研究结论翻译**：这项跨越15年以上的调查数据有助于更好地理解EBHS在地方性流行区的动态，并可为干预策略和改善狩猎区管理提供依据。
