《Molecular Plant Pathology》：The LRR Receptor-Like Kinase MdRLKT23 Confers Valsa Canker Resistance by Regulating the Degradation of the Susceptibility Factor MdSTK1 in Apple (Malus domestica)
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植物中的感病基因（susceptibility genes）通过支持病原菌与植物的亲和互作促进病原侵染。然而，植物如何限制感病因子的功能以增强免疫，目前仍很不清楚。本研究分离并鉴定了一个苹果感病基因MdSTK1（STE20家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1），其表达
植物中的感病基因（susceptibility genes）通过支持病原菌与植物的亲和互作促进病原侵染。然而，植物如何限制感病因子的功能以增强免疫，目前仍很不清楚。本研究分离并鉴定了一个苹果感病基因MdSTK1（STE20家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1），其表达受苹果腐烂病菌（Cytospora mali）侵染诱导。过表达MdSTK1显著削弱了对C. mali的抗性，而沉默MdSTK1则增强了苹果的抗性。MdSTK1与富亮氨酸重复类受体激酶（leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK）MdRLKT23发生物理互作。MdRLKT23正调控苹果对C. mali的抗性。MdRLKT23还可磷酸化MdSTK1。MdRLKT23促进MdSTK1蛋白丰度发生对MG132敏感的、依赖蛋白酶体的降低，从而激活植物免疫。综上，本研究为苹果LRR-RLK如何调控感病因子MdSTK1的蛋白稳定性以触发免疫提供了机制性见解。MdRLKT23–MdSTK1免疫模块的应用将为果树抗病育种奠定基础。
研究背景：植物通过细胞表面的模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），启动模式触发免疫（pattern-triggered immunity，PTI）；病原菌分泌效应子抑制免疫，效应子又可被胞内核苷酸结合富亮氨酸重复受体（nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors，NLRs）识别而触发效应子触发免疫（effector-triggered immunity，ETI），二者相互依赖。PRRs分为受体样激酶（receptor-like kinases，RLKs）和受体样蛋白（receptor-like proteins，RLPs），LRR-RLKs是最大的亚家族，可通过多种调控模式参与免疫。另一方面，凡是支撑病原侵染、维持亲和性的植物基因均可归为感病基因，病原菌常上调寄主感病基因表达以利于定殖；通过基因组编辑消除或修饰感病基因可获得持久、隐性遗传、广谱的抗性。感病基因的作用机制包括建立基础亲和性、维持持续亲和性及抑制寄主免疫信号。苹果（Malus domestica）为世界重要果树，中国产量与消费量最大；苹果腐烂病（apple Valsa canker，AVC）由子囊菌C. mali引起，经修剪伤口、微小损伤和树皮自然孔口侵入，向皮层、韧皮部乃至木质部扩展，形成病斑并致枝干枯死，严重影响东亚苹果生产。已有研究表明MdRLKT1/2为苹果防御的正调控因子，MdPR10、MdVQ29–MdWRKY23、MdMYB1r1–MdBGLU40等参与抗性，MdMRLK2负调控对C. mali的抗性。但苹果RLKs是否以及如何调控寄主感病因子以促进免疫仍 largely 未知，故开展本研究。
研究内容与结论：研究人员鉴定出受C. mali诱导的感病基因MdSTK1，证明其负调控苹果抗性；发现MdRLKT23与MdSTK1互作并磷酸化后者，且MdRLKT23通过促进对MG132敏感的、蛋白酶体依赖的MdSTK1蛋白丰度下降来激活免疫，从而抑制MdSTK1介导的感病性。该研究揭示了LRR-RLK限制感病因子功能的新机制，为果树抗病育种提供了基因靶标与理论基础。
主要关键技术方法（不超过250字）：以‘Gala-3’苹果组培苗、苹果愈伤组织及本氏烟（Nicotiana benthamiana）为材料，C. mali野生型菌株03–8用于接种；采用农杆菌介导的瞬时过表达与沉默及稳定转基因（过表达、RNAi）体系；酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）文库筛选（文库来自接种C. mali后0–72 hpi的枝条）、共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）、荧光素酶互补成像（luciferase complementation imaging，LCI）、GST pull-down、体外磷酸化、无细胞降解实验、亚细胞定位、ROS与胼胝质检测、flg22诱导的ROS爆发与MAPK激活分析、RT-qPCR及分子对接。
研究结果：
2.1 过表达MdRLKT23增强植物免疫：MdRLKT23含信号肽、LRR结构域、跨膜结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，与梨源受体样蛋白激酶高度同源，与AtEFR、TaXa21、OsXa21、ZmXa21中度相似；MdRLKT23-GFP与质膜标记TaWPI6-mCherry共定位，提示其为质膜定位的受体样激酶。瞬时过表达MdRLKT23增强苹果对C. mali的抗性，上调MdPR2、MdPR4，增加ROS积累与胼胝质沉积；在本氏烟中促进flg22诱导的ROS产生并加速flg22诱导的MAPK激活。结论：MdRLKT23增强多种防御反应。
2.2 MdRLKT23正调控苹果对C. mali的抗性：瞬时沉默MdRLKT23增大病斑；稳定RNAi株系（RNAi-2、RNAi-5，表达下降78%和85%）离体叶接种病斑大于野生型，整株接种结果一致；稳定过表达愈伤（OE-2/5/7，上调13.2、15.6、7.8倍）病斑显著减小，病原诱导的ROS积累更高。结论：MdRLKT23正调控抗性。
2.3 MdRLKT23与MdSTK1互作并磷酸化MdSTK1：以MdRLKT23激酶结构域（MdRLKT23-KD）为诱饵筛选Y2H文库获得MdSTK1；Y2H、Co-IP、GST pull-down、BiFC（细胞膜信号）、LCI均证实互作；分子对接预测二者激酶结构域的结合界面与互作残基。体外实验显示MdSTK1可自磷酸化，其N端含多个激酶催化活性位点残基，Lys-45与Asp-137突变为Ala的激酶失活突变体MdSTK1KM无磷酸化信号，但可被MdRLKT23-KD磷酸化。结论：MdRLKT23在细胞膜上与MdSTK1互作并磷酸化之。
2.4 MdSTK1在苹果对C. mali抗性中起负作用：MdSTK1含N端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（氨基酸14–287）而缺跨膜结构域，定位于质膜或近质膜；其转录在接种后36、48、72 hpi被诱导。瞬时过表达MdSTK1增大病斑、抑制MdPR2与MdPR4、降低ROS；沉默则相反。稳定RNAi愈伤（RNAi-4、RNAi-7，下降87%和70%）病斑小于野生型。遗传关系上，沉默MdRLKT23增大病斑、沉默MdSTK1减小病斑，二者共沉默表型与单沉默MdSTK1相似。结论：MdSTK1负调控抗性，MdRLKT23可能作用于MdSTK1上游。
2.5 MdRLKT23促进对MG132敏感的MdSTK1蛋白丰度下降：MdSTK1过表达病斑显著大于对照，MdSTK1/MdRLKT23共表达可减弱但未完全抑制病斑扩展。无细胞降解实验中，MdRLKT23过表达愈伤总蛋白加速GST-MdSTK1下降，MG132可抑制该下降；在本氏烟中共表达MdRLKT23-KD-GFP显著降低MdSTK1-mCherry丰度，且该降低被MG132抑制。结论：MdRLKT23促进对MG132敏感的、蛋白酶体依赖的MdSTK1蛋白丰度下降。
讨论与结论：研究人员指出，MdRLKT23激活免疫伴随防御基因表达、ROS积累与胼胝质沉积增强，符合RLK介导免疫信号的典型输出，可能以PTI信号通路依赖方式贡献抗性；其参与flg22诱导的ROS爆发提示可能作为PRR复合体组分，但上游激活信号与相关信号组分尚待阐明。MdSTK1属与酵母STE20结构功能相关的MAP4K家族，与拟南芥MAP4K3/MAP4K4的正向免疫作用相反，MdSTK1负调控苹果抗性，提示MAP4Ks在植物免疫中功能分化，可能取决于底物与信号背景；MdSTK1的直接下游靶标未知，其作为MAP4K未必位于经典MAPK级联上游。研究还指出病原菌常上调感病基因表达，MdSTK1在侵染中被诱导，与其感病促进作用一致；MdRLKT23的胞内激酶结构域与感病因子直接互作，建立了免疫相关RLK与感病因子的直接分子联系。磷酸化与泛素化存在广泛交叉调控，但现有数据未确立MdRLKT23介导的磷酸化与MdSTK1丰度下降之间的因果关系，研究人员推测磷酸化可能招募未知E3泛素连接酶导致靶向降解，尚待实验验证。结论（译）：综上，研究结果揭示MdSTK1通过调控防御基因表达与ROS积累发挥感病因子的功能；在C. mali侵染过程中MdSTK1表达显著上调，可能促进侵染进程；MdRLKT23与感病因子MdSTK1互作并磷酸化之，随后可能通过蛋白酶体介导的降解阻断MdSTK1的感病促进作用，从而激活植物免疫。研究为MdRLKT23破坏感病因子MdSTK1功能以增强植物免疫提供了机制性见解。
