《Protein Science》：Mechanism and regulation of Arabidopsis polyamine acetylation by NATA1 and NATA2
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多胺对维持植物生长和抗逆性至关重要。精胺/亚精胺N1-乙酰转移酶（SSATs）通过催化多胺的N-乙酰化来调控多胺丰度，从而减少多胺库并产生其他生物活性组分。拟南芥编码两个SSAT旁系同源基因——N-乙酰转移酶活性（NATA）1和2，其生理差异及调控机制尚不清楚
多胺对维持植物生长和抗逆性至关重要。精胺/亚精胺N1-乙酰转移酶（SSATs）通过催化多胺的N-乙酰化来调控多胺丰度，从而减少多胺库并产生其他生物活性组分。拟南芥编码两个SSAT旁系同源基因——N-乙酰转移酶活性（NATA）1和2，其生理差异及调控机制尚不清楚。本研究报道了NATA1和NATA2的8个晶体结构，为底物识别和催化过程中的构象动态提供了详细视图。生物物理分析揭示NATA2的热稳定性显著高于NATA1，提示NATA2在热胁迫下具有补偿作用。结合结构和生化方法，研究人员进一步发现胁迫诱导的酸性代谢物（包括谷氨酸和γ-氨基丁酸）可竞争性占据NATA活性位点并共同减弱多胺乙酰化。基于这些发现，研究人员提出了一种自调控机制：在逆境条件下，胁迫相关代谢物联合抑制SSAT活性以维持多胺库，同时保持基础乙酰化能力。该工作阐明了拟南芥中SSAT的活性与调控机制，并揭示了植物中胁迫代谢与多胺稳态之间此前未被认识的联系。
研究背景方面，多胺是富含氮的代谢物，在真核生物、细菌和古菌中介导多种生理功能。高等植物中最常见的多胺包括二胺腐胺和尸胺、三胺亚精胺和四胺精胺。多胺通过影响转录、RNA修饰、蛋白质合成、酶活性和信号通路在植物生理的多个方面发挥核心作用。多胺丰度通过输入、输出、合成、降解和化学修饰等途径调控。精胺/亚精胺N1-乙酰转移酶（SSATs）属于GCN5相关N-乙酰转移酶（GNATs）家族，以乙酰辅酶A（acCoA）为辅因子，将乙酰基转移至多胺末端氨基，从而降低多胺活性库。SSATs已在所有生物界中被鉴定。然而，植物SSATs的活性调控基础仍不明确。拟南芥中NATA1的表达受多种胁迫上调，包括冷、盐、干旱、创伤以及茉莉酸、细胞分裂素和多胺的添加。拟南芥及近缘物种的基因复制事件导致存在两个NATA基因，编码约80%氨基酸序列一致的蛋白质。与NATA1不同，NATA2不受细胞分裂素和多胺上调。NATA基因复制在拟南芥中的选择优势及NATA2的生物学作用仍不清楚。此外，考虑到NATA1和NATA2对多胺的催化活性普遍较低，且存在其他多胺分解代谢途径，NATA1和NATA2对植物生长的重要性尚不明确。基于此，研究人员结合结构生物学、生物化学和植物体内分析，阐明了拟南芥NATA1和NATA2的调控及生化差异，并提出了一种基于代谢物的自调控机制概念。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：（1）重组蛋白表达与纯化：将NATA1（19–228，NATA1Δ）和NATA2（30–236，NATA2Δ）截短体及全长NATA2克隆至pGEX6P-1载体，在大肠杆菌Rosetta 2（DE3）中表达，经GST亲和纯化后以凝胶过滤层析进一步纯化；（2）X射线晶体学：通过坐滴气相扩散法筛选结晶条件，在SOLEIL同步辐射光源PROXIMA 1和PROXIMA 2A线站收集数据，以人SSAT2结构（PDB: 2BEI）为搜索模型进行分子置换，使用Coot手动修正、Phenix Refine或BUSTER精修，共获得8个晶体结构（分辨率1.1–2.0 ?）；（3）差示扫描荧光法（DSF）：以Sypro Orange为染料，在CFX96实时热循环仪中以1°C/min从20至95°C升温，测定蛋白质热变性温度（Tm）；（4）DTNB乙酰转移酶活性测定：在Pherastar读板机上于25°C进行，以DTNB检测CoA生成量，底物和acCoA浓度分别为5 mM和0.5 mM；（5）等温滴定量热法（ITC）：在ITC200上于25°C测定NATA1Δ/NATA2Δ与acCoA/CoA的结合热力学；（6）植物材料与qRT-PCR：使用野生型Columbia-0和nata2突变体（Salk_092319），在正常（23°C）或热胁迫（28°C或37°C）条件下生长，以肌动蛋白（At3g18780）为内参进行qRT-PCR分析；（7）AlphaFold3建模用于预测底物和代谢物在活性位点的结合模式。
研究结果方面：（1）NATA1和NATA2在体外具有相似的广泛底物偏好性——通过在Tris8.5和Tris7.5缓冲液中测定重组NATA1Δ和NATA2Δ对多种底物的催化活性，发现两者均能乙酰化硫赖氨酸、1,3-二氨基丙烷、精胺、腐胺、鸟氨酸和赖氨酸，NATA2对鸟氨酸的乙酰化效率极低，整体上两者底物谱相似；（2）NATA1和NATA2结构高度相似——解析的8个晶体结构中，NATA1（残基22–227）和NATA2（残基29–236）催化结构域均采用交织的α/β二聚体结构，与细菌、动物和苔藓SSAT全局RMSD为2.4 ?，植物特异性约35残基插入形成额外的β链和短α螺旋，与细菌和动物同源物局部RMSD达7.65 ?；（3）NATA1和NATA2晶体结构呈现开放和闭合构象——NATA2结构揭示两种构象：开放态（底物和辅因子结合位点暴露于溶剂）和闭合态（底物结合口袋和acCoA乙酰基尾部被周围蛋白元件遮蔽），NATA1Δ所有结构均采用闭合构象，开放至闭合转变涉及NATA2区域39–82和196–201的协同收缩运动以及161–188残基的外移和部分重构；（4）NATA2热稳定性高于NATA1——DSF测定显示apo NATA1Δ的Tm为42.5±0.7°C，显著低于apo NATA2Δ的Tm（66.5±0.5°C），50 μM acCoA使NATA1Δ的Tm升高10°C，而对NATA2Δ仅轻微稳定，两者结合acCoA的Kd均约10 μM，NATA1Δ在30°C以上乙酰化精胺能力下降，45°C完全失活，而NATA2Δ对鸟氨酸的活性在45°C时反而升高，NATA2转录水平在37°C热胁迫2小时内升高，NATA1残基V75、Q146和V181在NATA2中分别被F82、P154和Y189替换，FOLDX计算支持这些残基对NATA2稳定性的贡献；（5）NATA1和NATA2底物结合口袋可容纳酸性化合物——NATA1/2底物结合口袋底部由二聚体每条链各提供一个精氨酸（NATA1中R183/R214，NATA2中R191/R222）形成二精氨酸基序，朝向底物非乙酰化端，该基序在苔藓和细菌SSAT中也存在，而在人SSAT中该位点正电荷较少，晶体结构中HEPES的硫酸基团被二精氨酸侧链配位，鸟氨酸的酸性基团也被NATA1二精氨酸基序配位；（6）酸性内源代谢物调控NATA催化活性——5 mM HEPES使NATA1Δ和NATA2Δ对精胺的乙酰化降低约80%，5 mM GABA或谷氨酸同样有效抑制精胺乙酰化，5 mM各化合物使NATA1Δ对精胺和鸟氨酸的乙酰化降低70–80%，但对1,3-二氨基丙烷的抑制明显较弱（低于20%至略高于30%），等浓度谷氨酸、香豆酸、脱落酸和GABA混合物仅需各约60 μM（总约250 μM）即可显著降低精胺和硫赖氨酸乙酰化，模拟胁迫条件的代谢物混合物（谷氨酸:香豆酸:水杨酸:茉莉酸-异亮氨酸=1:0.5:0.12:0.05）从4、2、0.48和0.04 mM起始可抑制约80%的NATA1催化活性，证实协同作用模式；（7）NATA活性位点口袋可能通过别构效应影响催化——闭合状态下NATA1和NATA2在二精氨酸基序附近保留未被共结晶化合物占据的大空腔，NATA2Δ结构中该口袋含甘油分子，乙二醇显著抑制NATA1Δ对精胺和1,3-二氨基丙烷的活性，而甘油和己二醇影响轻微。
讨论部分总结：本研究通过解析NATA1和NATA2的8个结构，获得了底物结合和催化相关构象转变的详细认识，证实植物特异性35残基插入在拟南芥SSAT中部分结构化，为该区域作为配体结合位点提供了可能性。NATA1和NATA2在体外显示高度相似的催化性质、结构和配体相互作用，但NATA2热稳定性显著更高，且NATA2在热胁迫下强烈上调而NATA1不上调，提示NATA2在热胁迫下补偿NATA1功能丧失。NATA1和NATA2在胁迫下过表达而其作用降低具有保护作用的多胺浓度这一调控悖论，可通过代谢物水平自调控机制来解释：NATA活性位点的二精氨酸基序等立体化学特征使活性位点具有足够通透性以催化多胺乙酰化，同时允许酸性竞争物抑制。HEPES紧密结合该口袋并强烈抑制催化，引导研究人员鉴定出香豆酸、脱落酸、茉莉酸-异亮氨酸、GABA和谷氨酸等内源植物代谢物同样抑制底物乙酰化。抑制具有底物选择性，小底物1,3-二氨基丙烷的转化仅受轻微影响，表明抑制反映结合口袋内的空间和静电竞争而非均一催化抑制。不同胁迫相关酸性代谢物的抑制效果可叠加。强效体外抑制发生在胁迫条件下代谢物的生物学浓度范围内。研究结论翻译：本研究阐明了植物SSATs/NATAs的底物周转机制，并鉴定NATA2为在热胁迫下获得重要性的旁系同源蛋白。研究结果提出假说：NATA1和NATA2进化出将代谢信号整合入酶调控的底物结合口袋，胁迫下酸性代谢物积累将抑制多胺乙酰化从而保持保护性多胺库，同时该抑制不影响二氨基丙烷的乙酰化，其修饰形式本身可能支持胁迫耐受性。这种选择性、代谢物介导的调控假说为植物胁迫响应中多胺稳态的动态控制提供了机制框架。
