QueF腈还原酶：催化机制与生物催化剂开发进展

《Protein Science》：QueF nitrile reductases: Catalytic mechanism and advances in biocatalyst development

　　

腈到胺的还原是有机合成和工业合成中的关键转化，可获得与制药、农化和材料制造相关的伯胺。QueF腈还原酶（NiREDs）代表一类独特的生物催化剂，能够在温和条件下催化NAD(P)H依赖的腈的四电子还原。尽管具有生物催化潜力，QueF酶的实际应用受到极其狭窄的底物范围的严重制约。本综述对QueF研究进行了全面分析，从发现、结构和机制阐明到最新的蛋白质工程努力。实验证据表明，活性位点的长期进化优化——以高度专业化的底物结合口袋为特征——是QueF底物特异性的主要决定因素。对关键活性位点残基与底物官能团之间关系的批判性分析，整合了结构、突变和计算见解，合理解释了选择性趋势。最终，本工作概述了扩展QueF底物耐受性相关的基本挑战，并确定了未来工程的可行策略。持续进展将依赖于对催化机制、活性位点动力学和协调多残基重新设计的更深入理解，将QueF定位为开发下一代腈还原生物催化剂的有价值模型系统。

**1 引言**

胺类化合物在有机化学、化学生物学和药物化学中是一类极其重要的化合物。其固有的亲核性和反应性使胺成为多功能的合成手柄和生物活性分子（如天然产物和药物）中不可或缺的功能基序。胺被视为制药、农化和聚合物工业中不可或缺的合成子。其合成和生物学双重相关性推动了催化方法学的广泛发展。近期实例包括钯催化芳基卤化物的胺化、烯烃或炔烃的氢胺化和氢胺甲基化、以及均相还原胺化或醇的直接胺化。虽然这实现了显著的方法学进展，但这些方法在底物反应性、官能团耐受性和可持续性方面存在局限，且通常需要贵金属、苛刻反应条件或保护基操作。在不同胺类中，伯胺是特别有价值的目标，既是合成中的关键中间体，也是生物活性分子中的突出结构基序。因此，腈到伯胺的转化已成为一种有吸引力的转化，氢化仍是工业生产的主导路线，原因在于其高原子效率、有机腈的相对低成本和高可用性，使其从绿色化学角度具有吸引力。然而，这些还原通常依赖于多相催化剂（如Raney Ni或Pd、Pt、Ru等贵金属催化剂，或基于Co、Sm和In的替代体系）上的高压氢化，或依赖于化学计量的氢化物试剂如LiAlH₄，这可能需要专门的压力设备、涉及危险试剂并在下游后处理中产生大量废物。作为突出例子，腈到胺路线是研究性抗高血压药nepicastat、抗抑郁药venlafaxine和抗过敏药epinastine以及织物柔软剂和润滑剂等胺基家用产品生产的基石。

然而，化学和制药制造业脱碳的压力日益增大，推动着用更良性的替代方案取代工业相关转化。生物催化路线在此背景下被广泛视为一种绿色可行的途径，提供了补充平台，缓解了传统催化的若干局限，包括对贵金属的依赖、苛刻反应条件、能源密集型过程、副产物形成和低反应选择性。生物催化和蛋白质工程的持续研究正在拓宽可用的生物催化工具箱，工业采用也在增长，逐步为关键化学转化解锁更绿色的替代方案。为此，QueF腈还原酶已成为在环境良性条件下将腈转化为伯胺的有前景候选者，提供了化学计量和金属催化方法的替代方案。迄今为止，QueF是已知唯一能催化直接腈到胺还原的酶家族。值得注意的是，进化上高度保守的活性位点赋予QueF酶严格的底物特异性，限制了其工业适用性。近期的蛋白质工程和机制研究集中于扩展其底物范围并理解这一现象背后的原因。对这些酶活性位点的探索已鉴定了结合和催化残基以及控制辅因子和底物识别的保守基序。尽管QueF具有独特的化学性质和生物催化潜力，但其作为腈还原生物催化剂的开发鲜有综述，此前的工作主要考察了与生物催化剂开发相关的结构和机制方面。此后，底物选择性和蛋白质工程研究扩展了对该酶家族的理解，但将非天然底物选择性的结构决定因素与工程结果联系起来的系统分析仍然缺乏。因此，本综述总结了QueF的发现和进化历史、目前对催化机制和底物范围的认识以及蛋白质工程的最新进展，整合这些发现以合理解释过去的工程努力，从而为开发具有扩展合成用途的变体提供框架。

**2 QueF家族的发现和表征：一类独特的腈还原酶**

7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤还原酶（QueF；EC 1.7.1.13）是一种NADPH依赖性氧化还原酶，催化前所未有的腈官能团的生物学还原。具体而言，QueF将天然底物7-氰基-7-脱氮鸟嘌呤（preQ₀）转化为7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤（preQ₁），这是queuosine生物合成途径中的关键步骤。该反应将QueF定义为一类独特的酶，在初级代谢中没有密切的功能类似物。

Queuosine是一种超修饰核苷，位于带有5′-GUN-3′反密码子的tRNA的摆动位置（第34位），在细菌和真核生物中广泛保守。在插入tRNA并经过后续修饰步骤后，queuosine增强密码子-反密码子相互作用并调节翻译效率。

PreQ₀是queuosine和众多其他天然存在的含7-脱氮鸟嘌呤核苷的核心前体。它由鸟苷5′-三磷酸（GTP）通过涉及QueD、QueE和QueC酶协同作用的四步途径生物合成，随后由QueF介导将preQ₀还原为preQ₁。该途径由GTP环水解酶I（GCYH-I；FolE）启动，将GTP转化为7,8-二氢新蝶呤三磷酸（H₂NTP）。GCYH-I属于隧道折叠（T-fold）超家族，其成员尽管催化嘌呤和蝶呤衍生代谢物的化学上不同的反应，但共享特征性结构架构。Schimmel、de Crécy-Lagard及其同事鉴定了细菌queuosine生物合成所需的基因，为随后QueF的生化表征提供了遗传基础。PreQ₁作为preQ₀的还原产物，是该途径中的关键中间体，因为它可以被tRNA-鸟嘌呤转糖基酶（TGT）酶掺入DNA和tRNA中。这一能力强调了QueF在使7-脱氮鸟苷修饰核苷可及方面的生物学重要性。有趣的是，比较基因组分析揭示了与GTP环水解酶I（GCYH-I）的显著同源性，导致其最初被归类为推定的GCYH-I同源物。尽管存在这种同源性，但未观察到QueF的环水解酶型活性，而是其通过来自NADPH的氢负离子转移对preQ₀到preQ₁的NADPH依赖性还原。

与queuosine生物合成途径相关的含腈代谢物已在五种细菌中进行了广泛研究：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、嗜热芽孢杆菌和胡萝卜果胶杆菌。来自枯草芽孢杆菌（bsQueF）和大肠杆菌（ecQueF）的QueF酶首先由Iwata-Reuyl、de Crécy-Lagard及其同事克隆和表征，他们证明QueF催化preQ₀到preQ₁的NADPH依赖性四电子还原，将其鉴定为第一个生物腈还原酶。随后Swairjo及其合作者报道了bsQueF的第一个晶体学数据。此后进行了阐明酶促机制的机制研究，并确认了通过活性位点半胱氨酸结合中间体的共价催化。底物结合触发的（而非硫代亚胺酸酯形成的）活性位点关闭、bsQueF功能性十聚体的稳定化、ecQueF中发现的门控机制等动态特征在QueF家族中得到了表征。在这些发现的基础上，Klempier及其同事使用底物结合位点的计算建模和ecQueF的定点突变来研究该酶的极端底物特异性。鉴定出广泛的口袋特异性相互作用网络是天然底物preQ₀特异性的主要来源，为未来的结构引导工程铺平了道路。在另一项研究中，bsQueF被证明在氧化条件下在Cys55和不变的Cys99之间形成可逆的分子内二硫键，保护催化半胱氨酸免于过度氧化。后来Nidetzky及其同事的工作鉴定了ecQueF中发现的活性位点门控机制，参与隔离反应性亚胺中间体。

Cunningham、Joachimiak及其同事发表了霍乱弧菌QueF（vcQueF）的第一个高分辨率晶体结构，以及底物和NADPH结合的模拟引导模型，支持了在其他QueF酶中阐明的催化机制。Fernandes、Liang、Hirao及其同事随后对vcQueF的补充QM/MM研究提出了催化途径的详细机制描述，与现有实验观察一致。

Klempier及其同事从嗜热芽孢杆菌中克隆并表征了第一个嗜热QueF（gkQueF），揭示了明显的温度依赖性，在25至65°C之间对preQ₀的比活性增加了12倍，在所报道的测定条件下最高测试温度时达到约0.08–0.09 U mg^?1。55°C下的稳态动力学分析显示，gkQueF还原preQ₀的周转数为3.9 min^?1 ± 0.6 min^?1，对应催化效率（k_cat/K_m）为0.35 min^?1 μM^?1。与其嗜热起源一致，该酶还表现出显著的热稳定性，55°C下半衰期约为43 h，在TCEP存在下降低至约15 h。值得注意的是，gkQueF的晶体结构尚未见报道。最近，Zhang、Xu及其同事鉴定并生化表征了来自胡萝卜果胶杆菌的QueF（pcQueF），其催化活性显著高于先前报道的QueF酶。在相同测定条件下，pcQueF的比活性为0.366 U mg^?1，约为gkQueF（0.140 U mg^?1）的2.6倍，而其40°C下半衰期为13.6 h。定点突变后，H224N pcQueF变体的比活性进一步提高至0.526 U mg^?1，同时热稳定性改善，40°C下半衰期为32 h。

**3 保守结构特征和折叠**

与GCYH-I GTP环水解酶类似，QueF属于隧道折叠（T-fold）超家族，该超家族包含催化密切相关的嘌呤和蝶呤型底物上多种反应的酶。这些T-fold结构域通常跨越120–160个残基，采用ββααββ拓扑：四条反平行β链形成扭曲的β折叠，β2和β3之间有两条反平行螺旋。小单体单元组装成同源寡聚体以形成β_2nα_n桶状结构，两个桶以头对头方向结合形成活性酶。

QueF酶包含两种不同的结构架构类型：枯草芽孢杆菌（bsQueF）和嗜热芽孢杆菌（gkQueF）中典型的YkvM亚家族酶，以及从大肠杆菌（ecQueF）、霍乱弧菌（vcQueF）和胡萝卜果胶杆菌（pcQueF）中分离的YqcD亚家族酶。

在结构组成方面，两个亚家族共享相同的QueF模块，嵌套在围绕活性位点的螺旋结构中。此外，YkvM亚家族与YqcD酶中存在的T-fold结构域C端区域显示序列相似性，可能表明祖先的复制和融合事件。

属于YkvM型的酶采用约160个残基的单模块结构，其中10个相同结构域组装成同源十聚体状态：结构域形成五聚体排列，进一步二聚化形成十聚体支架（五聚体的二聚体）。这些酶最初被提出形成同源十二聚体，解释为六聚体的二聚体。然而，更仔细的晶体学分析揭示了不对称单元中的五个单体，应用晶体学二重对称产生了完整的寡聚体，即由两个五聚体环以头对头形式排列组成的十聚体。每个五聚体是单个（β2α）2-桶状亚基的环状组装。在单亚基水平上，核心T-fold由扭曲的反平行β折叠组成，与两条反平行α螺旋堆积，随后是额外的螺旋和约10个残基的短C端延伸。

相比之下，YqcD亚家族酶建立在其双模块结构中，同一多肽内有两个串联的T-fold模块，其中2条约280个残基的相同链形成同源二聚体，具有链内活性位点，因此缺乏经典的季T-fold结构。每个单体采用紧凑的α/β架构，围绕七链反平行β折叠构建，由八条α螺旋和连接环围绕。N端模块（残基57–136）由三条β链组成，两侧有两条螺旋，与COG2904超家族相关，而C端模块（残基176–271）类似T-fold，由四条β链和两条螺旋组成。这表明整体折叠似乎源于铁氧还蛋白样模块的内部复制。

在早期研究中，两个亚家族的天然四级结构通过尺寸排阻色谱（SEC）确定。野生型和His-6标签bsQueF（YkvM亚家族）酶的洗脱体积分别测定为12.2和11.9个亚基，与十二聚体结构的分子量一致。相比之下，野生型和His-6标签ecQueF（YqcD亚家族）酶的洗脱分别为1.8和1.9个亚基，表明同源二聚体结构。这一观察得到了vcQueF的额外SEC实验和bsQueF的初步X射线衍射分析的支持。

**4 活性位点**

YkvM型和YqcD型亚家族的QueF酶均以嵌入α螺旋片段上的短高度保守基序E(S/L)K(S/A)hK(L/Y)(Y/F/W)（其中h表示疏水性氨基酸）为特征，其相对于其他催化元件的位置因其模块架构而异。在单模块YkvM QueF（bsQueF）中，该基序位于单个T-fold内，两侧为保守的Cys55（N端侧）和Glu97（C端侧）残基。在双模块YqcD QueF（ecQueF）中，保守的Cys190和Glu230在空间上与基序分离，位于不同结构域上而非单个T-fold单元内。保守的Cys55（Cys190）是两个关键催化残基之一，积极参与还原机制，将底物锚定为酶共价结合中间体，另一个是Asp62（Asp197），在两氢负离子转移步骤中充当质子供体。PreQ₀通过多种相互作用保持在结合口袋内的生产性取向（残基编号参照bsQueF野生型氨基酸序列，括号中显示相应的ecQueF残基位置）。Glu97（Glu230）与位置1的环氮（N1）和环外氨基氮（N2）形成氢键；preQ₀羰基氧（O6）通过氢键与His96（His229）的主链酰胺氮相互作用；Glu78（Glu89）与底物的位置9氮（N9）相互作用；Val77（Ile88，该残基基于与vcQueF的同源性）和Ser79（Ser90）分别与N2和preQ₀的位置3氮（N3）形成氢键。除氢键相互作用外，preQ₀与Phe33、Phe95和Ile130（Phe228、Leu191、Ile192）之间建立疏水/π-π堆积接触以将底物保持在位。在催化过程中，两个QueF亚家族都隔离反应性硫代亚胺酸酯中间体：在YkvM中，preQ₀共价结合驱动位点的亚基间关闭，而在YqcD中，门控环和壁残基密封链内口袋以排除 bulk water。

五个最常研究的QueF酶的序列被比对和比较，以说明保守的QueF基序和该酶家族报道的关键催化和结合残基，揭示了亚家族间的高度保守性。bsQueF和gkQueF中的催化Cys55、ecQueF和pcQueF中的Cys190、vcQueF中的Cys194占据活性位点的等效位置，作为亲核试剂与preQ₀形成共价硫代亚胺酸酯中间体。bsQueF和gkQueF中保守的Asp62、ecQueF和pcQueF中的Asp197、vcQueF中的Asp195同样在催化途径中发挥关键作用，稳定共价中间体并将质子 relay 到活性位点。它们的保守性强调了这些残基在维持QueF活性中的进化重要性，并支持目前接受的催化机制。尽管gkQueF和pcQueF的活性位点尚未详细结构解析，但它们与bsQueF（对于gkQueF）和ecQueF（对于pcQueF）的强序列相似性允许使用后者作为结构和机制参考。

**5 反应机制**

如前所强调，保守的半胱氨酸和天冬氨酸残基长期以来被认为是负责天然底物preQ₀还原的关键催化残基。尽管两个亚家族共享还原的核心化学，但鉴于YkvM和YqcD变体之间的模块差异，结构差异突出。迄今为止，最全面的机制报道集中于bsQueF、ecQueF和vcQueF酶，因此以下机制综述以这些酶为例。

最近的工作表明，QueF催化依赖于水介导的质子 relay 机制，其中底物在双模块YqcD型ecQueF酶中功能性偶联到His-H₂O-Asp桥。该网络作为质子供应，并且带有正电荷的His229侧链还有助于底物的极化并可能促进来自进入的NADPH的氢负离子转移。此外，一旦共价硫代半缩醛胺中间体分解为非共价结合的亚胺，Cys190可被Asp197重新质子化，有效逆转初始质子转移过程。

然而，在bsQueF中，结构分析将Asp62置于与共价Cys55-preQ₀硫代亚胺酸酯中间体的直接氢键接触中，与作为直接质子供体的角色一致，而His96位于闭合活性位点中的相邻位置，被提出支持该质子化步骤。因此，His-H₂O-Asp桥的存在尚未在YkvM酶中得到确认。

preQ₀到preQ₁还原的机制可分为四个阶段：C?S共价键的形成；NADPH的第一次氢负离子转移；C?S共价键的断裂；NADPH的第二次氢负离子转移。进入活性位点口袋后，preQ₀最初非共价结合，并通过氢键和疏水相互作用网络稳定，使腈定向以进行催化半胱氨酸的亲核攻击。底物结合后，活性位点关闭，排除 bulk water，同时保留质子穿梭所需的有组织水 relay。在反应的第一步中，催化Cys190被激活并对preQ₀的腈碳进行亲核攻击，而保守的Asp197向氮提供质子（随后由环境再生），生成共价Cys190-底物硫代酰胺样中间体12a。中间体随后通过来自NADPH的氢负离子转移被还原，涉及Asp197的进一步质子化步骤驱动硫代亚胺酸酯12a向硫代半缩醛胺12b的转化。在这些步骤之后，C?S键的断裂通过His229-H₂O-Asp197网络的质子转移促进，该网络重新质子化催化Cys190，从而将共价加合物释放为游离亚胺中间体12c。当第二个NADPH递送最终氢负离子时，催化循环完成，产生preQ₁ 13。

**6 NADPH的作用**

QueF通过四电子过程催化腈还原，其中两分子NADPH提供氢负离子当量，而质子转移由活性位点残基介导。NADPH消耗的化学计量和共价硫代亚胺酸酯中间体的形成通过底物滴定实验确定，监测376 nm处的吸光度变化（对应硫代亚胺酸酯形成）和340 nm处（反映NADPH氧化）。除了作为氢负离子供体的作用外，NADPH在YqcD型QueF中的结合模式一直是广泛研究的主题。早期结构建模和分子动力学模拟表明，每个vcQueF二聚体包含两个等效的底物结合位点，均能够与preQ₀形成共价加合物。然而，底物结合酶的建模表明NADPH的腺嘌呤部分无法容纳在 occupied 活性位点内。在此基础上，提出了一个推测性模型，其中NADPH结合置换一分子preQ₀，允许辅因子的腺嘌呤部分占据底物结合口袋，而氢负离子转移发生在对侧单体位点。随后采用天然电喷雾电离质谱（ESI-MS）的实验工作为底物和辅因子的结合化学计量提供了直接约束。这些研究表明，两分子preQ₀对称结合到二聚体ecQueF酶上，而在任何给定时间每个二聚体仅结合一分子NADPH，无论底物和辅因子添加的顺序如何。重要的是，NADPH结合被证明独立于底物占据，排除了互斥的底物-辅因子结合模型，并反驳了早期NADPH结合在preQ₀口袋内的提议。然而，NADPH结合也被证明加速硫代亚胺酸酯形成（约4倍）并在还原步骤期间紧密结合在酶-preQ₀-NADPH复合物中，表明一种调节性结合模式，确保底物的完全还原并限制部分还原中间体的释放。总体而言，这些发现支持修订的机制模型，其中NADPH结合在不同的界面位点，与两个底物结合口袋空间分离。这种架构在二聚体内强制执行功能不对称性，使得两个结合的底物分子中只有一个一次被还原，与半位点反应性一致。由于每个二聚体在任何给定时间只能结合一个NADPH分子，两个底物分子的完全还原需要多次连续的NADPH结合事件。结构分析表明，ecQueF的底物结合口袋具有由Glu89和邻近残基如Ile192和Cys190形成的狭窄入口，形成通道，NADPH的烟酰胺部分必须穿过该通道到达其反应位置。有趣的是，C190A和D197H突变显示没有NADPH结合受损的证据，且C190A和C190S变体被报道将preQ₀转化为preQ₁而无 detectable 副产物形成。尽管不是决定性的，这些发现与绕过共价硫代亚胺酸酯中间体形成的还原途径一致，对此已提出两种替代机制情景。

**7 突变研究**

YkvM型和YqcD型QueF变体均进行了定点突变研究，主要旨在评估、确认和阐明preQ₀腈到胺还原的催化机制，或旨在拓宽严格的底物特异性；在重叠之处，那些以工程为重点的结果在下一节中讨论。

**7.1 YkvM亚家族**

在YkvM型QueF酶中，Cys55被鉴定为保守催化残基。该归属基于bsQueF与大肠杆菌GCYH-I的同源性及其相似的同源十聚体四级结构，这推动了该位置的早期定点突变。将Cys55替换为丙氨酸或丝氨酸（C55A、C55S）导致对preQ₀的活性完全丧失，即使在底物和酶过量的条件下也是如此。这些实验证明该残基对催化不可或缺，与共价Cys-底物中间体机制一致。圆二色谱（CD）和色谱分析确认这些变体保留了天然同源十聚体寡聚状态，表明活性丧失最可能反映催化失活而非十聚体的结构破坏。第二个突变系列靶向实验观察到的bsQueF中Cys55和Cys99之间的保守分子内二硫键，该二硫键被提出在体内保护催化半胱氨酸免于不可逆的过度氧化。将Cys99替换为丙氨酸或丝氨酸（C99A、C99S）不损害活性，表明二硫键不是催化机制的一部分，而是作为氧化还原保护性"关闭开关"发挥作用。在gkQueF中观察到类似效果：C55A变体也未显示可检测的preQ₀还原，支持该催化特征在YkvM型亚家族内的保守性。

gkQueF中的额外替换——H96A/F、E97A/S和F95A——被引入以测试是否可以通过减少强极性接触来拓宽活性位点以接受preQ₀类似物，但这些变体均未显示非经典腈的转化，强调了YkvM型QueF的严格底物特异性。

**7.2 YqcD亚家族**

对ecQueF活性位点的系统机制研究集中于催化Cys190-Asp197-His229三联体。催化亲核试剂Cys190被替换为丙氨酸和丝氨酸（C190A、C190S），而His229被替换为丙氨酸（H229A）。Cys190的改变完全消除了对preQ₀的活性：C190A和C190S均未形成特征性硫代亚胺酸酯中间体，尽管仍观察到非共价底物结合。相比之下，将His229突变为丙氨酸（被提出参与His-水-Asp质子 relay）并未阻止共价加合物的形成。这些结果确认了His229在促进质子转移中的辅助作用，但表明它并非严格必需 for 催化本身，与Cys190相反。

确认ecQueF中Asp197残基的关键作用（被提出在腈还原期间介导质子转移）来自靶向定点突变研究。该位置的变体（D197N、D197A和D197H）导致对天然底物的活性完全丧失，与Asp197在Cys190激活和早期催化中间体稳定化中的双重作用一致。值得注意的是，在NADPH结合背景下探测Asp197表明该残基不控制辅因子结合，暗示其在质子穿梭而非NADPH识别中的必要功能。

第二组突变靶向ecQueF中物理隔离催化中间体与 bulk solvent 的preQ₀结合口袋：His89、Leu191、Ile192、Phe228及周围位置。这些残基有助于正确定向preQ₀并随后密封活性位点，从而保护反应性亚胺/硫代亚胺酸酯中间体免于水解。当His89和Phe228被替换（E89A、E89L、F228A）时，仍观察到底物的共价捕获，但催化不再有效进行至preQ₁。相反，这些变体主要释放7-甲酰基-7-脱氮鸟嘌呤，与过早的溶剂暴露和亚胺中间体的水解分解而非完成完整四电子还原一致。相比之下，催化半胱氨酸附近移动结构元件内的替换（L191A和I192A）产生混合结果，同时检测到preQ₁和水解产物。这表明活性位点盖的部分打开损害但不完全消除中间体的隔离。总之，第二组突变表明这些残基的主要作用是架构性的而非催化性的。

相关见解已从结构同源的vcQueF酶中获得，该酶已在多个催化状态中结晶。突变体如C194S和C194A（靶向等效催化半胱氨酸）、H233A（靶向提出的质子 relay 组氨酸）和R262L被生成并进行结构表征。这些vcQueF变体主要用作结构模型而非动力学基准生物催化剂：晶体结构和模拟捕获了酶与preQ₀、共价结合的硫代亚胺酸酯中间体、产物（preQ₁）以及包括NADPH的三元复合物的复合物。C194S的量子力学/分子动力学（QM/MM）分析表明，将催化半胱氨酸替换为丝氨酸提高了共价加合物形成的能垒，使途径显著不利并暗示活性丧失。与此一致，C194A被发现以非共价方式在晶体中结合preQ₀和preQ₁，但被预测对天然底物无催化能力。相反，H233A仍形成共价preQ₀加合物，与His233在质子转移中的辅助（而非严格必需）作用一致。总体而言，vcQueF的突变支持从ecQueF推断的相同机制图景：催化半胱氨酸及其酸性伙伴对催化是必需的，而附近的组氨酸有助于质子运动和中间体稳定化。

最后，在pcQueF型酶中，突变不仅用于探测机制，还用于改善对preQ₀的生物催化性能。催化半胱氨酸周围的活性位点口袋衬里残基被系统地进行丙氨酸扫描，排除催化三联体（Cys190-Asp197-His229）。在变体L37A、L95A、S99A、N101A、H224A、Q231A、D23A、N38A、N98A、F100A、Q102A、E230A和C232A中，只有一部分保留了对preQ₀的可测量（尽管降低的）活性。然后在最有希望的位置进行饱和突变，产生第二代突变体（N38G/E、S99G、H224V/T/N、N98G），其中H224N表现出比野生型酶高约1.5倍的比活性。结构建模表明，在野生型酶中，His224与Gln102形成亚基间氢键，部分阻碍亚基间底物通道。在H224N变体中，Asn224反而与主链Phe222和Arg223形成环内氢键网络，将侧链重新定位远离通道，从而为底物和辅因子进入打开额外空间，导致活性增强。

**8 底物选择性和混杂性研究**

高度保守的活性位点赋予所有表征的QueF酶严格的底物特异性。迄今为止，天然底物preQ₀是唯一已知的完全转化为相应伯胺preQ₁的有机腈。与这种特异性一致，密切相关的类似物，即6-氧代取代类似物15、2-氨基取代类似物19和2-氨基-6-氧代取代类似物22显示出降低的活性。尽管如此，拓宽这些酶底物范围的努力包括使用野生型和突变体QueF的广泛筛选。考虑的腈底物被分为两个不同的类别：（i）从preQ₀形式上相关的天然底物类似物，显示密切或更远的结构相似性；（ii）与非类似物的脂肪族或芳香族腈，与模板底物preQ₀基本无相似性[F]。类别（i）可根据所触及的原始preQ₀官能团进一步分为5类：[A] 6-氧代取代变体；[B] 2-氨基取代变体；[C] 2-氨基-6-氧代取代变体；[D] 环变体，其中preQ₀骨架的吡咯和/或吡啶部分被改变；[E] 带有杂项结构修饰的底物。然而，除了上述三种类似物（化合物15、19和22）外，没有测试的腈化合物被报道对研究的QueF野生型酶显示活性。

最近的蛋白质工程努力主要集中在gkQueF和ecQueF上，分别代表YkvM样和YqcD样亚家族的成员，旨在将其催化活性扩展到非天然腈。最近，野生型pcQueF已针对更广泛的一组非经典底物进行了评估。

**8.1 PreQ₀样类似物（A-C类）**

蛋白质工程研究主要集中在gkQueF（YkvM）和ecQueF（YqcD），因为它们代表了QueF两个已建立结构谱系的理想模型并已详细晶体学表征。采用的一般策略是放松在N2和O6处接触preQ₀的识别元件——His96（His229）用于O6，Glu97（Glu230）用于N2以及附近的支持残基（Val77/Ser90），试图以生产性姿势容纳一组类似物进行催化。例如，在gkQueF中，引入替换H96A、H96F、E97A和E97S以削弱或重塑这些相互作用。所有四个变体对preQ₀显示相对于野生型降低的活性，对2-氨基类似物19（B类）仅有残余活性，而对6-氧代类似物15（A类）的活性降低更多。相应的ecQueF变体（H229A、E230Q）显示相同趋势：preQ₀周转降低，对底物16、18、20或21测试时无 detectable 产物。总体而言，这些数据指出6-氧代接触（His96/His229线）是preQ₀样类似物的关键相互作用，并且它们表明简单去除单个H键供体/受体主要降低对preQ₀的活性而不赋予对类似物的活性。一个例外是类似物22（C类），其在N2和O6位置同时带有修饰：ecQueF E230Q仍能处理该底物，尽管速率明显降低。这表明N2/O6周围极性/H键环境的适度变化（E230Q）可以恢复密切类似底物的活性。然而，效果仍然 minor，且仅限于preQ₀的三个最接近类似物（15、19和22），并未使酶对非天然底物广泛混杂。

**8.2 环修饰类似物（D类）**

[D]类中的类似物保留N2或N3或N9和7-氰基官能团的相对位置，但改变杂芳族支架本身。为了容纳这些更灵活的环系统，突变被导向定义活性位点口袋壁的残基。在gkQueF中，这些包括F95A、H96A、H96F、E97A和E97S，靶向O6-/N2-位置的极性接触和相邻的芳香表面；在ecQueF中，这包括E89A、E89L、S90A、F228W、H229A和E230Q，它们共同修饰口袋入口和与preQ₀六元面接合的芳香结合表面。预期是在这些位点减少空间位阻或去除极性侧链将为环改变底物创造足够空间，同时保持7-腈官能团对催化半胱氨酸的正确位置。在功能上，这些替换被证明基本非生产性。放松环结合残基一致降低对preQ₀的活性，但未产生对环修饰腈的可检测周转。这一结果与QueF口袋高度方向性的结构图景一致。催化半胱氨酸必须从定义的轨迹接近7-腈，芳香表面围绕平面脱氮嘌呤核心精细塑造。一旦这些约束被放松，酶失去特定的预组织，所创造的空间不足以（或方向不正确）稳定替代环系统。

**8.3 杂项腈底物（E类）**

E类中的底物保留脱氮嘌呤核心结构，但要么（i）将腈官能团从C6（底物12，preQ₀）重新定位到C7（例如底物29），要么（ii）在O6/N2引入额外取代（羰基和/或氨基）以及8-溴取代基（底物30–32）。对于gkQueF，筛选了第7.1和8.2节中讨论的相同突变体组（H96A/F、E97A/S和F95A）以削弱结合口袋内的强极性接触；然而，对任何测试的E类底物均未检测到转化。类似地，先前引入的ecQueF变体——E89A/L、S90A、C190A、D197N、F228W、H229A和E230Q——被设计通过模拟环堆积相互作用（F228W）、将酰胺官能团交换为谷氨酰胺（E230Q）以及调节侧链极性/长度（E89A/L和S90A）来扩展底物范围，而额外突变靶向催化Cys190-Asp197-His229三联体。在所有情况下，未观察到底物29–32转化为相应伯胺。

**8.4 非类似腈底物（F类）**

最后，评估了广泛的非脱氮嘌呤腈，主要使用野生型pcQueF和可用的野生型及突变体bsQueF/gkQueF/ecQueF变体。在该面板中未观察到可测量的转化，确认QueF不表现为广谱腈还原酶，而是作为高度专业化的preQ₀还原酶，其催化机制依赖于同时识别多个杂原子和环接触。这与三个最接近的preQ₀衍生类似物形成对比——那些缺乏6-氧代基团、2-氨基基团或两者的类似物——它们仍显示低但可检测的活性，强调了QueF目前能耐受的天然支架偏差之小。尽管如此，这些最小扰动类似物至少被处理的事实表明，N2-O6位点的靶向重塑结合腈部分的仔细保留可能为未来工程尝试中的底物拓宽提供可行途径。

**9 结论和展望**

近几十年来，QueF家族的腈还原酶已成为还原少数有机腈的高度专业化生物学解决方案。机制、结构和突变研究揭示了它们如何通过保守半胱氨酸-天冬氨酸对介导的共价结合中间体和在能够稳定水敏感中间体的严格水限制活性位点环境中精细进化的质子 relay 网络实现前所未有的生物催化转化。这种精确进化的机制也是QueF酶在生物催化应用中局限性的主要原因。由于对唯一代谢物preQ₀的严格进化专业化，QueF酶具有通过大量保守极性、芳香和几何相互作用网络专门识别脱氮嘌呤支架的底物结合口袋。因此，即使底物结构的微小扰动通常也耐受性差，且大多数突变努力损害了天然活性而没有显著获得底物范围。未来的挑战将集中于克服这种进化专业化而不破坏腈还原所需的精细催化机制。传统的定点突变策略和有限数量的天然存在野生型QueF的表征不足以观察到底物混杂性的任何变化，表明可能需要更具变革性的方法。这些可能涉及定向进化和计算或AI辅助方法来重塑结合口袋的整体拓扑和动力学。此外，在未探索或已灭绝的系统发育分支中大规模探索天然进化QueF同源物的序列空间可能导致具有放松特异性的变体。同时，更深入地理解活性位点动力学、溶剂门控和辅因子偶联对于指导这些努力至关重要。尽管QueF酶可能永远不会产生通用腈还原酶，但整合前沿结构生物学、计算和现代酶工程方法可以为工业相关腈提供定制的QueF衍生催化剂，帮助推进更可持续的伯胺路线。