凝血酶原二硫键状态连接其开放与闭合构象

《Protein Science》：Disulfide bond status links the open and closed conformations of prothrombin

　　

新出现的证据表明，蛋白质的结构变化可影响自身免疫识别。靶向中枢血液凝固蛋白凝血酶原（prothrombin）的抗体常在抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome, APS）患者中检出。凝血酶原以闭合构象与开放构象之间的动态平衡形式存在，其中开放构象的抗原性更强。研究人员采用差异半胱氨酸烷基化结合质谱分析，证明凝血酶原在循环中以一系列部分二硫键成键的蛋白质状态存在。使用识别开放构象的抗体从混合血浆中免疫沉淀凝血酶原，可获得富含未形成二硫键的凝血酶原分子的组分。对二硫键进行遗传学消除（ablation）显示，各个二硫键可调节凝血酶原开放与闭合构象之间的平衡。kringle-1（C65–C143与C114–C138）、kringle-2（C191–C231）及蛋白酶结构域（C293–C439、C493–C507与C521–C551）中未形成的二硫键与蛋白质结构向更开放构象偏移相关，该结论经增强的糜蛋白酶（chymotrypsin）可及性及与开放构象抗体结合增强所评估。上述发现表明，凝血酶原的二硫键状态参与开放与闭合构象平衡的调控。

研究背景与问题：抗磷脂综合征（APS）的诊断实验室标准主要集中于狼疮抗凝物（LA）、抗心磷脂抗体及抗β2-糖蛋白I（β2GPI）抗体，而抗凝血酶原抗体检测日益被用作改善风险分层的附加诊断工具。抗凝血酶原抗体，尤其是针对凝血酶原-磷脂酰丝氨酸复合物的抗体，与APS的关键临床特征（血管血栓形成与产科并发症）密切相关。其促血栓活性的致病机制已有多种假说，但病理性自身抗体识别凝血酶原的结构基础仍不完全清楚。新出现的证据提示凝血酶原的构象可塑性参与APS中的自身抗体识别。循环中凝血酶原约80%以闭合构象存在，闭合型结构紧凑，以kringle-1与丝氨酸蛋白酶结构域之间的稳定相互作用为特征；开放构象则呈延展结构，各结构域沿主轴垂直排列。这些结构差异改变表位可及性，部分被称为type-I的抗凝血酶原抗体选择性识别开放构象。研究人员此前发现，多种主要血浆蛋白（包括纤维蛋白原、α2-巨球蛋白、血管性血友病因子）以及膜受体αIIbβ3与Mac-1均以部分二硫键成键形式组成性产生，其他研究者亦在凝血因子XII与IgG分子中观察到部分未形成的二硫键。在这些蛋白质中，一定比例的键在合成过程中保持未形成状态，产生群体水平的半胱氨酸氧化还原异质性。本研究报道凝血酶原在血液中以一系列二硫键成键状态循环，其研究提示凝血酶原的二硫键影响开放与闭合构象之间的平衡，这可能构成凝血酶原在APS中抗原性的基础。

研究内容与结论：研究人员通过差异半胱氨酸烷基化与质谱分析，在健康供者血浆中定量了凝血酶原24个半胱氨酸中的21个（代表12个二硫键中的11个），发现所有二硫键均以形成与未形成状态的混合形式存在，其中丝氨酸蛋白酶结构域内多个二硫键在循环分子中有相当比例（约1/10至1/5）未形成，表明凝血酶原以二硫键成键状态异质性混合物形式循环。使用识别开放构象的POmAb进行免疫沉淀，发现结合组分相对于总血浆池与未结合组分富集含未形成二硫键的凝血酶原分子，说明POmAb优先识别由二硫键状态界定的亚群，反映的是对既有构象状态的选择性富集而非抗体诱导的平衡偏移。通过将最常未形成的二硫键的两个半胱氨酸突变为丙氨酸构建变体，发现消除一个二硫键并不显著改变其他二硫键的状态，且多数变体保留相当促凝活性，而C293A,C439A变体活性严重降低。采用限制性糜蛋白酶水解与POmAb结合动力学两种方法评估构象平衡，发现除C348A,C364A外的六个二硫键变体均向开放构象偏移，其中缺失C191–C231、C293–C439、C493–C507或C521–C551的变体对POmAb的结合亲和力增加3至9倍。研究的重要意义在于揭示二硫键状态是凝血酶原开放-闭合构象平衡的调控因素，可能解释其在APS中的抗原性。

关键技术方法：研究采用差异半胱氨酸烷基化结合质谱分析（同位素标记试剂¹²C-IPA与¹³C-IPA）定量血浆凝血酶原各半胱氨酸的氧化还原状态；通过免疫沉淀（使用多克隆抗凝血酶原抗体及开放构象单克隆抗体POmAb）分离特定亚群；构建双半胱氨酸至丙氨酸突变的凝血酶原变体并在HEK293T细胞中稳定表达、经离子交换层析纯化；采用LA敏感的活化部分凝血活酶时间（aPTT）测定促凝活性；以限制性糜蛋白酶水解评估构象可及性；以表面等离子共振（SPR）测定与POmAb及活性位点配体argatroban的结合动力学。血浆样本来自健康志愿者，经悉尼大学人类研究伦理委员会批准（伦理批号2014/244）。

研究结果：（1）凝血酶原在血浆中以一系列二硫键成键状态循环：通过差异半胱氨酸烷基化与质谱分析定量21个半胱氨酸的氧化还原状态，发现所有二硫键均以形成与未形成状态混合存在，多个二硫键（尤其蛋白酶结构域内）在相当比例循环分子中未形成，C65–C143、C114–C138与C191–C231两个配对半胱氨酸的氧化还原状态差异显著，提示部分分子中可能存在替代共价构型或翻译后修饰。（2）开放构象抗体选择性结合特定二硫键成键亚群：以POmAb免疫沉淀混合血浆凝血酶原，结合组分相对于总池与未结合组分富集含未形成二硫键的分子，表明POmAb优先识别由二硫键状态界定的亚群。（3）消除凝血酶原二硫键保留促凝活性：构建七个双半胱氨酸至丙氨酸变体，消除一个二硫键不显著改变其他二硫键状态；C65–C143、C114–C138或C493–C507缺失变体凝血时间与野生型相似，C191A,C231A、C348A,C364A与C521A,C551A变体凝血时间延长2至3倍，C293A,C439A变体延长约10倍、活性严重降低。（4）凝血酶原二硫键状态调节开放与闭合构象平衡：限制性糜蛋白酶水解显示七个二硫键变体中六个出现明显水解，提示向开放构象偏移；SPR显示缺失C191–C231、C293–C439、C493–C507或C521–C551的变体POmAb结合亲和力增加3至9倍，源于结合速率增加；kringle-1变体C65A,C143A与C114A,C138A几乎不结合POmAb，且argatroban不增强其结合，提示可能为抗体结合位点破坏而非向闭合构象偏移；C521A,C551A变体POmAb亲和力最高且argatroban无进一步增强，提示未形成的C521–C551键使平衡偏向以开放构象为主。

讨论与结论：讨论指出，蛋白质以异质性二硫键成键形式产生可能是成熟蛋白质广泛且具生理相关性的特征；C47–C60、C86–C126、C170–C248与C219–C243等仅在极小比例中未形成的二硫键可能代表凝血酶原结构的必要元件。配对半胱氨酸氧化还原状态差异的可能解释包括非天然二硫键形成及半胱氨酸的翻译后修饰（如S-谷胱甘肽化）阻断烷基化标记。凝血酶原闭合构象促进Arg320位点切割，开放形式则优先经prethrombin-2途径激活，二硫键变体多呈开放构象，预期会改变其与凝血酶原酶复合物的相互作用及两个切割位点的相对可及性。C521–C551键（凝血酶编号C191–C220）突变已被证明扰动钠结合位点并显著降低凝血酶蛋白水解活性，而C293–C439键（凝血酶编号C1–C122）共价连接A链与B链，对凝血酶功能不可或缺。POmAb作为模型type-I抗体识别的表位中心位于kringle-1残基Cys86、Leu88、Arg90-Tyr93与Gln110-Glu111，与C86–C126及C114–C138二硫键重叠或相邻，与SPR结果一致；C65–C143键不直接位于该抗体界面附近，其消除可能诱导kringle-1结构域内更广泛的构象变化而间接损害表位形成。结论为：凝血酶原的二硫键状态参与其开放与闭合构象平衡，未形成的二硫键（kringle-1的C65–C143与C114–C138、kringle-2的C191–C231以及蛋白酶结构域的C293–C439、C493–C507与C521–C551）与蛋白质结构向更开放构象偏移相关，这一二硫键状态可能构成凝血酶原在APS中抗原性的基础。