磷脂膜组成调控早期人胰岛淀粉样多肽淀粉样蛋白的结构演化

《Protein Science》：Lipid membrane composition modulates the structural evolution of early-stage human islet amyloid polypeptide amyloids

　　

2型糖尿病（T2D）中，人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）在胰腺内的聚集是驱动β细胞进行性死亡的分子因素。研究团队前期研究表明，hIAPP可形成两种不同的淀粉样寡聚体：在路径上的环形寡聚体（DOs）和在路径外的圆形寡聚体（ROs）。既往研究亦表明，脂质作为细胞内含量最丰富的生物分子类别之一，可改变hIAPP淀粉样纤维形成的动力学，并模板化结构上不同的hIAPP纤维。然而，特定脂质环境对早期hIAPP淀粉样蛋白演化的影响尚不清楚。本研究采用原子力显微镜（AFM）和原子力显微镜红外（AFM-IR）光谱技术，解析在磷脂酰胆碱（PC）或磷脂酰丝氨酸（PS）存在下形成的早期hIAPP DOs、ROs和纤维（FBs）的形态学与结构动力学。PC模板化的DOs以平行β-折叠结构为主，而PS模板化的DOs以反平行β-折叠为主。这些DOs仅存在于聚集的早期阶段。相反，ROs持续存在，且其结构演化无论脂质环境如何均更具随机性。脂质模板化DOs的二级结构与早期FBs的二级结构精确相关，凸显了其作为hIAPP聚集过程中在路径上寡聚体的作用。最后，聚集过程中存在的脂质环境独特地改变了FBs的结构演化，PC有利于反平行β-折叠FBs的逐步增加，而PS有利于平行β-折叠的增加。这些结果为脂质丰富的细胞环境中hIAPP聚集机制提供了关键见解，同时巩固了脂质作为hIAPP聚集早期阶段关键参与者的地位。

**研究背景与问题**

2型糖尿病（T2D）是一种影响全球超过5.2亿人的衰弱性疾病，人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）的聚集是其标志性特征。在约90%的病例中，hIAPP淀粉样寡聚体和纤维（FBs）在胰岛内积累，对β细胞产生高度细胞毒性。β细胞丢失导致胰岛素不足和慢性高血糖状态，加速T2D病理进程及其相关并发症。此外，hIAPP淀粉样蛋白还可交叉播种淀粉样β蛋白（Aβ）和α-突触核蛋白（α-syn）的聚集。研究团队近期研究表明，hIAPP聚集产生两种结构和形态不同的淀粉样寡聚体：平行β-折叠富集的环形寡聚体（DOs）和反平行β-折叠富集的圆形寡聚体（ROs）。DOs在聚集4小时后不再存在，而ROs在24小时后仍持续存在，提示DOs为"在路径上"寡聚体，演化为平行β-折叠富集的FBs，而ROs为"在路径外"的持续性寡聚体。同时，脂质可显著改变hIAPP的聚集，脂质膜的存在可模板化形态和结构上不同的纤维多晶型。然而，特定脂质环境对早期hIAPP淀粉样蛋白演化的影响仍未知。本研究旨在阐明脂质如何改变早期聚集阶段hIAPP DOs、FBs和ROs的结构演化。

**主要技术方法**

研究人员使用由1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸（DPPS）和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）组成的单脂质大单层囊泡（LUVs）作为模型膜，在生理条件（37°C，pH 7.4）下聚集hIAPP，在不同时间点（0.5、1、2、16 h）收集样品，通过原子力显微镜（AFM）和原子力显微镜红外（AFM-IR）光谱进行分析。AFM用于可视化蛋白聚集体的形态，AFM-IR用于探测单个寡聚体和纤维的二级结构。通过酰胺I带的Gaussian峰拟合量化各二级结构的相对含量。hIAPP（1–37）为合成多肽，脂质购买自Avanti Polar Lipids。

**研究结果**

**DPPC和DPPS独特地改变早期DOs、FBs和ROs的二级结构和形态**：研究人员利用AFM-IR光谱分析hIAPP:PC和hIAPP:PS条件下1 h的DOs、2 h的ROs和1 h的FBs。DPPC条件下1 h的DOs二级结构为27.9% ± 1.0%平行β-折叠、21.4% ± 0.7%反平行β-折叠、1.9% ± 0.1%无规卷曲和48.75% ± 1.3% β-转角/α-螺旋；DPPS条件下1 h的DOs为18.6% ± 2.2%平行β-折叠、31.5% ± 4.1%反平行β-折叠、26.4% ± 4.3%无规卷曲和23.6% ± 2.8% β-转角/α-螺旋。hIAPP:PS DOs（8.25 ± 2.04 nm）显著厚于hIAPP:PC DOs（6.56 ± 1.91 nm）。DPPC条件下1 h的FBs为31.8% ± 2.9%平行β-折叠、27.9% ± 2.3%反平行β-折叠、2.1% ± 0.1%无规卷曲和38.2% ± 1.1% β-转角/α-螺旋；DPPS条件下1 h的FBs为34.7% ± 9.0%平行β-折叠、34.6% ± 2.2%反平行β-折叠、2.5% ± 2.5%无规卷曲和28.2% ± 5.3% β-转角/α-螺旋。hIAPP:PS FBs（6.05 ± 1.32 nm）显著厚于hIAPP:PC FBs（5.06 ± 1.41 nm）。DPPC条件下2 h的ROs为22.0% ± 11.0%平行β-折叠、27.34% ± 5.33%反平行β-折叠、9% ± 9%无规卷曲和41.7% ± 8.5% β-转角/α-螺旋；DPPS条件下2 h的ROs含19.3% ± 9.8%平行β-折叠、16.8% ± 12.3%无规卷曲、显著较少的β-转角/α-螺旋（8.5% ± 4.5%）和显著较多的反平行β-折叠（55.5% ± 2.1%）。hIAPP:PS ROs（6.66 ± 1.39 nm）显著小于hIAPP:PC ROs（10.69 ± 2.84 nm）。

**不同聚集阶段hIAPP聚集体形态和二级结构的纳米尺度分析揭示独特的二级结构演化**：对于DOs，DPPC条件下0.5 h的DOs厚度为7.56 ± 1.65 nm，二级结构均匀分布（28.6% ± 1.1%平行β-折叠、24.5% ± 1.4%反平行β-折叠、24.6% ± 1.7%无规卷曲、22.4% ± 2.0% β-转角/α-螺旋），1 h时转变为更有序、显著更富β-转角的组成；DPPS条件下0.5 h的DOs厚度为7.93 ± 1.41 nm，含高度β-折叠和β-转角结构，1 h时构象变为更富无规卷曲的结构。两种脂质条件下2 h和16 h均未观察到DOs。与无脂质条件相比，脂质膜显著压缩了DOs的物理尺寸并加速其清除。对于FBs，DPPC条件下0.5 h的FBs具有混合的β-转角/β-折叠富集二级结构（25.6% ± 2.9%平行β-折叠、22.2% ± 1.5%反平行β-折叠、2.8% ± 0.2%无规卷曲、49.3% ± 2.2% β-转角/α-螺旋），厚度为6.49 ± 2.42 nm，随时间推移反平行β-折叠增加而β-转角/α-螺旋减少；DPPS条件下0.5 h的FBs以反平行β-折叠为主（24.3% ± 1.4%平行β-折叠、52.4% ± 4.2%反平行β-折叠、2.5% ± 2.5%无规卷曲、21.1% ± 4.3% β-转角/α-螺旋），随时间推移平行β-折叠显著增加（16 h达41.9% ± 2.8%），反平行β-折叠减少（16 h为28.1% ± 3.5%），且晚期DPPS模板化FBs显著增厚。对于ROs，DPPC条件下ROs从无序逐渐重组为β-折叠和β-转角富集结构（16 h时反平行β-折叠达53.6% ± 5.6%，无规卷曲降至2.6% ± 0.1%），厚度保持恒定（约10–12 nm）；DPPS条件下ROs表现出显著的物理变薄（0.5 h的10.43 ± 2.5 nm降至16 h的7.2 ± 2.6 nm），伴随随机的二级结构波动。

**讨论与结论**

本研究证明，由两种化学性质不同的磷脂DPPC和DPPS组成的LUVs独特地改变了hIAPP聚集的早期阶段。AFM观察到三种形态不同的hIAPP聚集体群体（DOs、FBs和ROs），与无脂质条件下观察一致。DPPC或DPPS均未定性破坏聚集体类别或其总体进程。DOs在两种脂质环境中1 h后不再存在，而无脂质环境中DOs持续至4 h，表明脂质不仅加速hIAPP聚集，还改变DOs形成和演化的动力学。DPPC和DPPS在聚集过程中产生同一时间点两种不同结构的DOs，PC有利于平行β-折叠形成，PS有利于反平行β-折叠。hIAPP FBs随时间结构演化，且该演化由脂质环境的化学性质决定：DPPC条件下FBs随时间β-转角/α-螺旋减少、反平行β-折叠增加，PS模板化FBs平行β-折叠增加、反平行β-折叠减少。DOs的二级结构与FBs的结构演化良好相关，DPPC条件下DOs在消散前以平行β-折叠为主，hIAPP:PS DOs以反平行β-折叠为主，这与各条件下早期FBs的结构特征一致。ROs虽也随脂质环境独特演化，但更具随机性且与FBs共同持续存在。因此，研究人员得出结论：hIAPP DOs是演化为FBs的在路径上寡聚体，而ROs是持续存在的在路径外寡聚体物种；这些个体物种的结构演化由聚集过程中存在的特定脂质环境决定。研究的局限性包括使用严格由DPPC或DPPS组成的单脂质LUVs作为模型膜界面，天然胰腺β细胞质膜更为复杂，未来需使用模拟β细胞膜不对称性和相行为的生理相关脂质混合物进行研究。样品沉积和环境干燥可能诱导毛细力使软蛋白组装体扁平化，但由于所有样品采用相同制备方案，表面诱导的扰动在各条件间是系统且均匀的，所报道的多晶型差异和时间依赖性二级结构轨迹反映了真实的脂质模板化重塑而非样品制备伪影。