《Experimental & Molecular Medicine》：WNK kinases control RNF43 plasma membrane levels to fine-tune WNT signaling
编辑推荐：
E3泛素连接酶RNF43与ZNRF3是经典WNT信号通路的关键负调控因子，促进质膜上WNT受体Frizzled与LRP5/6的周转。尽管其作用机制已较为明确，但RNF43/ZNRF3自身如何被调控仍不清楚。本研究通过邻近标记蛋白质组学（proximity la
E3泛素连接酶RNF43与ZNRF3是经典WNT信号通路的关键负调控因子，促进质膜上WNT受体Frizzled与LRP5/6的周转。尽管其作用机制已较为明确，但RNF43/ZNRF3自身如何被调控仍不清楚。本研究通过邻近标记蛋白质组学（proximity labeling proteomics）鉴定出WNK激酶为RNF43的调控因子。利用功能获得与功能缺失策略，研究人员证明WNK激酶控制RNF43的质膜定位及其下调WNT受体的能力。药理学抑制WNK可增加RNF43的膜丰度并增强WNT抑制——该效应在RNF43/ZNRF3双敲除细胞与类器官中消失。机制上，WNK抑制改变RNF43的转运与泛素化，揭示WNK在调控其质膜分布中的作用。这些发现揭示了一条连接WNK促WNT活性与RNF43/ZNRF3介导的反馈抑制的新调控轴，并将WNK抑制确定为一种在携带RSPO融合或RNF43突变的癌症中恢复WNT通路控制的潜在治疗策略。
**研究背景** 经典WNT–β-catenin信号通路在胚胎发育与成体组织干细胞自我更新中发挥核心作用，其信号水平的精细平衡对维持增殖与分化稳态至关重要。WNT信号失调与多种疾病包括结直肠癌（CRC）密切相关。RNF43及其旁系同源物ZNRF3（R/Z）是含有Really Interesting New Gene（RING）结构域的跨膜E3泛素连接酶，通过泛素化依赖的方式将WNT受体Frizzled（FZD）和低密度脂蛋白相关蛋白5/6（LRP5/6）靶向至内体-溶酶体降解，从而有效抑制WNT信号。然而，R/Z自身活性如何被调控尚不清楚。R/Z的胞外结构域含有蛋白酶相关（PA）结构域参与蛋白-蛋白相互作用，跨膜结构域可能决定对FZD受体的选择性，而长的胞质尾则参与调控R/Z活性。分泌型WNT激动剂R-spondins（RSPO1/2/3/4）与R/Z及含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体（LGR4/5/6）形成多蛋白复合物，该复合物被迅速内吞，从而阻止R/Z对FZD/LRP的降解并增强WNT信号。在胞内调控方面，散乱蛋白（DVL）与RNF43相互作用并将其桥接至FZD，促进受体泛素化与降解；RNF43胞质尾的磷酸化可作为磷酸开关调控其对FZD的抑制活性；DAAM1/2则参与RNF43泛素化后FZD的内化过程。为更全面地表征R/Z的调控机制，研究人员开展了基于过氧化物酶邻近标记的高通量相互作用组分析，以鉴定RNF43的新调控因子。WNK激酶是一类独特的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其激酶结构域中催化赖氨酸的位置非典型。WNK在离子转运调控中发挥关键作用，WNK1或WNK4突变与Gordon综合征（以高血压和高钾血症为特征）相关。近年来，WNK激酶在肿瘤发生中的作用受到关注，其失调与肿瘤生长、转移和血管生成相关。值得注意的是，WNK激酶与WNT信号通路存在交互作用：在果蝇中WNK可影响Dishevelled（Dsh）的磷酸化状态从而调节经典WNT信号；在哺乳动物细胞中WNK为β-catenin稳定所必需。尽管有这些初步发现，WNK在WNT信号调控中的精确作用及机制仍不明确。本研究旨在阐明WNK激酶调控RNF43及WNT信号的分子机制，并评估WNK抑制作为WNT过度激活癌症治疗策略的潜力。论文发表在《Experimental & Molecular Medicine》。
**关键技术方法** 研究人员采用了双重邻近标记策略：将工程化大豆抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）融合于RNF43胞质尾C端以标记胞质侧互作蛋白，将辣根过氧化物酶（HRP）插入RNF43胞外域以标记质膜外侧互作蛋白，结合质谱（MS）分析鉴定RNF43相互作用组。建立了多西环素诱导的稳定表达RNF43-APEX2和HRP-RNF43的T-REx 293细胞系。利用SNAP标签和HiBiT纳米荧光素酶系统定量检测RNF43质膜水平。采用TOPFlash荧光素酶报告基因检测WNT信号活性。使用WNK抑制剂STOCK2S-26016和WNK463进行药理学功能缺失实验。利用野生型及R/Z双敲除小鼠小肠类器官（SIO）评估WNK抑制的生理相关性，并建立了携带PTPRK–RSPO3融合的小鼠小肠类器官模型。此外，采用非洲爪蟾胚胎双轴诱导实验验证RNF43融合蛋白的功能完整性。
**研究结果**
**用于探测RNF43相互作用组的双重邻近标记策略** 研究人员构建了RNF43-APEX2和HRP-RNF43两种融合蛋白，在HEK293T细胞中过表达后均保留降解FZD受体和抑制WNT信号的能力，与野生型RNF43相当。在非洲爪蟾胚胎中，两种融合蛋白均能抑制xWnt8诱导的二次轴形成，证实其功能完整性。建立的稳定细胞系在多西环素诱导下可稳健表达融合蛋白并展现强生物素化活性，且仍对RSPO1/2的WNT激动效应保持响应。
**RNF43相互作用组的蛋白质组学分析揭示WNK1和SORTILIN为新互作因子** HRP-RNF43介导的生物素化主要捕获跨膜受体和分泌型配体，包括已知的RNF43靶标如PTK7、ROR1/2、LRP6及多个FZD家族成员，以及TGFβ/BMP和EGF/FGF受体酪氨酸激酶家族成员。APEX2介导的标记主要富集内吞和內体转运相关蛋白，以及内质网/高尔基体分泌通路组分和多种胞质激酶。值得注意的是，胞质激酶WNK1和跨膜分选受体SORTILIN分别从APEX2和HRP标记中鉴定为新候选因子。共免疫沉淀实验证实了RNF43与内源性WNK1、转染的WNK2以及SORTILIN及其同源物SORL1之间的稳健相互作用。添加重组RSPO3蛋白或RSPO1条件培养基不影响RNF43与其靶标的结合。
**WNK通过RNF43调控WNT信号** 转染WNK2足以增加HEK293T细胞中的WNT–β-catenin信号活性，该效应依赖于WNT配体分泌，因为Porcupine抑制剂IWP2可消除WNK过表达的效果。WNK抑制剂STOCK2S-26016（WNKi）有效抑制经典配体WNT3A诱导的信号激活，并显著削弱RSPO1条件培养基对WNT信号的增强效应。WNK2的激酶活性对其功能至关重要，激酶失活突变体WNK2K207A无法增强WNT信号，而组成型活性突变体WNK2S356E则进一步增强WNT活性。上位性分析表明，过表达β-catenin或GSK3抑制剂处理激活的TOPFlash报告基因不受WNK抑制影响，提示WNK作用于β-catenin降解复合体上游。R/Z双敲除细胞或过表达显性负性RNF43（ΔRING）的细胞对WNK抑制不响应。非偏倚质谱分析未检测到WNK1共表达或WNK抑制剂处理条件下RNF43特异性磷酸肽的变化，提示WNK可能通过非直接磷酸化机制调控RNF43。在小肠类器官中，WNKi显著损害囊性类器官的形成和生长，效果与IWP2相当，且可被LiCl挽救。R/Z双敲除类器官和APC?/?类器官对WNK抑制具有抗性。WNK463同样抑制野生型类器官生长而不影响R/Z双敲除类器官。免疫荧光分析显示WNKi和WNK463均显著降低活跃β-catenin（尤其是核质部分）及干细胞标志物CD44的水平。
**WNK调控RNF43质膜水平** 使用SNAP标签标记质膜RNF43的实验显示，WNKi处理细胞质膜上RNF43水平高于DMSO对照。HiBiT纳米荧光素酶实验定量显示WNK抑制导致HiBiT-RNF43表面水平增加约30%。免疫荧光实验表明WNK抑制显著增加RNF43与质膜标志物Desmoglein 2（DSG2）的共定位，同时也增强ZNRF3的质膜水平，表明R/Z两个旁系同源物均受WNK激酶调控。值得注意的是，WNK抑制还增加RNF43 I48T突变体的质膜水平，提示部分挽救其膜定位。HiBiT实验证实WNKi处理后FZD5表面水平显著降低。SNAP标签脉冲-追踪实验表明WNKi显著增加RNF43阳性细胞中FZD5胞内斑点的数量，在WNT3A存在条件下WNK抑制进一步加速表面FZD5的清除，提示WNK抑制优先加速WNT结合态FZD5池的转运和降解。RNF43 I48T突变体活性极低，但WNKi处理足以增加表达该突变体的细胞中FZD5+斑点的数量，并在TOPFlash实验中部分恢复其抑制WNT信号的能力。泛素化实验显示WNK过表达增加RNF43的K63连接泛素化水平，而WNK抑制剂降低K63连接泛素化，K48连接泛素化未受显著影响。总RNF43蛋白水平无重大变化，提示泛素化的RNF43可能经历溶酶体降解之外的命运——可能通过内体区室循环。
**WNK抑制损害由RSPO融合驱动的WNT成瘾类器官的生长** 研究人员建立了携带PTPRK–RSPO3（PR）融合的小鼠小肠类器官模型，该模型表达内源性RSPO3蛋白，可在无RSPO补充的WNT3A/EGF/Noggin（WEN）培养基中形成大型囊性结构。PR融合类器官与R/Z双敲除类器官类似，在IWP2存在下无法生长，表明依赖WNT配体分泌；而APC?/?类器官在所有条件下均稳健生长。WNK抑制剂显著减少PR融合类器官的囊性结构大小和数量，但对R/Z双敲除类器官无影响，提示WNK活性促进由上游通路激活驱动的一部分WNT成瘾类器官的生长。
**讨论部分总结** 本研究揭示了经典WNT信号中一条此前未被认识的WNK激酶与E3泛素连接酶RNF43之间的调控轴，为WNT通路调控增添了新的复杂性层次。通过互补的邻近标记策略，研究人员鉴定WNK为RNF43的新互作因子，将这些激酶与质膜上WNT受体周转的精细调控联系起来。功能上，WNK激酶调控RNF43的泛素化模式，药理学抑制WNK增加RNF43及其旁系同源物ZNRF3的质膜表达，导致经典WNT信号减弱。WNK与RNF43之间的上位性关系提示WNK激酶作用于WNT受体泛素化和内化上游，可能通过影响调控RNF43定位的转运机制实现。WNK如何调控RNF43质膜水平和活性仍是重要的开放问题。WNK是质膜蛋白定位和转运的公认调控因子，通过多种间接机制发挥作用而非直接修饰其货物蛋白。与这一范式一致，研究人员未检测到WNK依赖的RNF43磷酸化，提示WNK更可能通过间接机制调控RNF43，可能通过目前未鉴定的转运或内吞衔接蛋白控制其质膜分布和后续内化，或作用于分泌通路更早期阶段。更广泛地，本研究强调RNF43转运调控是WNT通路控制的关键层面。从治疗角度看，WNK抑制足以抑制携带PTPRK–RSPO3融合的小肠类器官模型的生长，且药理学抑制WNK可增加功能缺陷型RNF43 I48T突变体的质膜水平并部分挽救其WNT抑制功能，提示积累于内质网的RNF43致癌突变体可能并非不可逆地被困或失活，而是处于转运和激活缺陷状态且部分可逆。总之，本研究鉴定WNK激酶为RNF43定位和功能的关键调控因子，为理解WNK介导的WNT调控提供了框架，并突出了WNT成瘾肿瘤的潜在治疗策略。
