超越膜融合：SNARE蛋白作为信号传导与基因表达的调控因子

《Traffic》：Beyond Membrane Fusion: SNARE Proteins as Regulators of Signaling and Gene Expression

　　

可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）蛋白是膜融合和细胞内囊泡运输的关键介质。越来越多的证据表明，SNARE还参与信号通路和基因表达的调控。一些SNARE已被定位到细胞核或显示在细胞质和细胞核之间穿梭，而另一些则调节转录因子的核转位和活性。这些发现补充了SNARE作为膜融合介质的观点，并确定其为信号传导和基因表达的调控因子。理解这些非经典功能可能为生理和病理条件下基因表达调控的复杂性提供新的见解。

**1 引言**

细胞内区室和细胞器之间的通讯与运输对正常的细胞功能至关重要，由囊泡运输或通过膜接触位点的直接接触介导。囊泡运输途径涉及膜融合事件，主要由一类称为SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）的保守膜锚定蛋白介导。在哺乳动物中，已知有38种SNARE蛋白构成膜融合机制的核心。这些蛋白主要通过C端跨膜结构域（TMD）锚定于膜上，其特征是含有一个60–70个氨基酸的中央卷曲螺旋基序，称为SNARE基序。SNARE传统上根据其定位分为两类：位于靶膜上的t-SNARE和位于囊泡上的v-SNARE。然而，SNARE基序中中央氨基酸的性质目前决定了更准确的功能分类：R-SNARE和Q-SNARE，分别对应精氨酸和谷氨酰胺残基。Q-SNARE存在于靶膜上，包括syntaxin和SNAP等成员，而R-SNARE主要存在于囊泡上，包括囊泡相关膜蛋白（VAMP）和Sec22b等蛋白。Q-SNARE根据其在SNARE复合物（也称为反式SNARE复合物）中螺旋的具体位置细分为Qa-、Qb-、Qc-或Qb,c-SNARE。该复合物由一个R-SNARE和两到三个Q-SNARE组成，其组装从SNARE基序的N端开始，以拉链样方式向C端TMD锚定区推进。膜融合后，复合物从反式构型转变为顺式构型，必须迅速解离以便SNARE组分循环用于后续膜融合事件。此过程需要能量，由NSF和αSNAP蛋白提供。Sec1/Munc18样（SM）蛋白协调同源SNARE复合物的组装和稳定，确保高效的膜融合，而包括synaptotagmin在内的Ca²⁺传感蛋白控制膜融合的最终阶段。重要的是，SNARE组合以区室和细胞类型特异性的方式表达和分布，决定了膜融合事件的特异性和细胞内运输的方向性。

SNARE和膜运输是细胞信号传导的重要调控因子。SNARE及其调控伙伴的表达、丰度或可用性的改变可通过调节受体、配体和信号复合物的细胞内运输、定位和驻留时间来影响信号转导。一个经典例子是表皮生长因子受体（EGFR）通路，其中SNARE依赖性内吞运输有助于决定下游信号级联的持续时间、幅度和空间分布。因此，SNARE活性的影响超越了膜融合本身的控制，延伸到信号传导的时空控制。新兴证据表明，SNARE功能可能超越膜运输，包括对基因表达的直接和间接调控。因此，一些SNARE，包括选择性剪接异构体，可能进入细胞核并在其中执行多种调控活动。一些SNARE已被报道作为转录调控因子发挥作用，而另一些则介导或参与转录因子向细胞核的运输（表1）。这些发现挑战了SNARE仅作为膜融合介质的传统观点，并表明除了控制信号通路的空间组织外，SNARE还可以直接影响核反应和基因表达。在本综述中，研究人员讨论SNARE在基因表达调控中的非经典功能，重点聚焦其核定位、转录活性以及在转录调控因子运输中的作用。

**2 SNARE蛋白的核靶向与定位**

**2.1 STX17**

SNARE通常与细胞器和细胞膜相关联。SNARE能够进入细胞核的首批证据之一来自一项研究胰腺肿瘤发生的研究。Syntaxin 17（STX17）是一种Qa-SNARE，最著名的是其在自噬体成熟和与平滑内质网（ER）相关的自噬体-溶酶体融合中的作用，在酵母双杂交筛选中被鉴定为Rac相互作用蛋白。研究发现STX17在胰腺中的表达具有细胞类型特异性，主要在导管上皮细胞和胰岛细胞中表达。引人注目的是，STX17在这些细胞的细胞质和细胞核中均高表达。对各种器官、组织和细胞类型的分析显示，STX17在壁细胞、神经元、膀胱、软骨细胞和成骨细胞等中具有高核表达。相反，在骨骼肌和心肌细胞中，STX17几乎完全位于细胞质中。比较STX17在人导管腺癌和肝细胞系与正常胰腺导管和上皮细胞中的亚细胞定位，发现前者具有强烈的核表达。该研究中STX17核定位的机制尚未解决，因为生物信息学分析未能检测到推定的核定位信号（NLS），提示存在尚未表征的核运输机制。研究提出，除了在膜融合和囊泡运输中的作用外，STX17因其核定位可能参与细胞增殖或转化。最近一项研究比较了人、线虫和果蝇FLAG-STX17在HeLa细胞中表达时的定位和作用。STX17未被报道存在于这些细胞的细胞核中，提示其核定位可能仅限于某些细胞类型。显然需要进一步研究来验证STX17定位于肝癌细胞核的结论，包括在制备核和细胞质提取物时更好的实验对照。

**2.2 STX1B-ΔTMD**

Syntaxin的卷曲螺旋结构域是与其他SNARE相互作用所必需的，而C端TMD介导其与特定细胞内区室的关联。随着选择性剪接产生的新型syntaxin异构体的发现，syntaxin受到了关注。这些异构体可能在不同组织以及不同的亚细胞区室中表达。缺乏TMD的syntaxin异构体的存在提出了它们可能发挥膜融合/囊泡运输之外功能的可能。对一种遗传性婴儿疾病（发作性运动障碍）的基因组分析鉴定了经典syntaxin 1B（STX1B）转录本以及一种缺乏C端TMD的选择性剪接STX1B异构体（STX1B-ΔTMD）。STX1是一种Qa-SNARE，是介导神经元突触神经递质释放的胞吐机制的组成部分。STX1B完全定位于细胞质，而STX1B-ΔTMD主要存在于核质中。进一步实验证明，STX1B-ΔTMD的核靶向是Ran依赖性过程，需要一个15个氨基酸的C端序列作为NLS。虽然STX1B-ΔTMD的潜在功能未被探讨，但该研究的作者指出了研究该STX1B异构体在生理和病理条件下作用的重要性。在这方面，一个有趣的见解来自对原发性脑肿瘤患者的观察，即STX1B-ΔTMD表达水平较低与更好的生存率相关。该研究首次提供了证据表明选择性剪接可以产生缺乏TMD且能够进入细胞核的syntaxin异构体。

**2.3 STX3S**

Syntaxin 3（STX3）是一种Qa-SNARE，主要定位于顶端质膜和内体/溶酶体。旨在鉴定MDCK肾上皮细胞中新STX3相互作用伙伴的研究鉴定了RanBP5（也称为 karyopherin β3、importin β3或importin 5）。鉴于RanBP5在含有NLS的蛋白质从细胞质向细胞核运输中的作用，研究人员假设这种相互作用可能导致STX3在可溶形式下被导入细胞核。事实上，各种STX3缺失构建体的表达揭示，STX3在缺乏膜锚定结构域的情况下可能通过与其RanBP5的相互作用被主动运输到核质中。在表达序列标签（EST）数据库中BLAST搜索缺乏TMD的STX3异构体，鉴定出几个与存在跳过外显子10（导致TMD丢失）的异构体一致的EST。这种名为STX3S的新型异构体在HEK293T细胞中的表达通过RT-PCR确认，也被证明与膜锚定的STX3A一起在正常人肾脏中表达。此外，分析揭示STX3的细胞质结构域能够反式激活Gal4启动子活性，提示该结构域具有激活转录或与其他转录因子相互作用的能力。进一步实验揭示STX3S可以结合多种转录因子，包括ETV4（ETS变异转录因子4）和ATF2（激活转录因子2），且STX3S作为ETV4依赖性转录的共激活因子发挥作用。在CaCo2细胞中特异性沉默STX3S导致多个基因的差异表达，其中许多受ATF2调控。此外，沉默STX3S导致CaCo2细胞增殖增加，提出了STX3S作为肿瘤抑制因子的可能性。在发现这种缺乏TMD的可溶性剪接STX3变体后，研究人员在人类EST数据库中搜索了syntaxin的新型可溶性变体。除STX3S和先前报道的STX1B-ΔTMD外，还鉴定了STX4和STX10缺乏C端TMD的替代转录本。总之，该研究报告的结果表明，缺乏C端TMD的选择性剪接syntaxin基因转录本可能是产生靶向细胞核的可溶性异构体的机制的一部分，在那里它们可能参与基因表达和细胞功能的调控。

**2.4 SNAP-47**

R-SNARE VAMP7主要定位于晚期内体和溶酶体，尤其参与这些区室与其靶膜的融合。在MDCK细胞中寻找VAMP7新相互作用伙伴的研究鉴定了SNAP-47。这种Q-SNARE定位于细胞质、ER和ER-高尔基体中间区室（ERGIC），可能调控早期分泌途径。它与其他SNARE相互作用并促进其正确的亚细胞定位。一致地，除VAMP7外，SNAP-47被发现与VAMP4、VAMP7和VAMP8以及STX5和STX1相互作用，表明它可以与ER/ERGIC区室中存在的syntaxin形成复合物。此外，SNAP-47被发现与KIFAP3（驱动蛋白相关蛋白3）和MACF1（微管肌动蛋白交联因子1）（参与肌动蛋白和微管动力学）以及鸟嘌呤交换因子ARF-GEF1/BIG1相互作用。为进一步研究这些相互作用，在HeLa细胞中表达了缺乏C端部分的截短SNAP-47（ΔCter-SNAP-47），发现其与VAMP4、VAMP7和VAMP8的相互作用受损。有趣的是，ΔCter-SNAP-47主要定位于细胞核。序列预测分析表明N端区域存在推定的NLS基序，C端序列存在推定的核输出信号。用leptomycin B（CRM1/exportin1依赖性核输出的抑制剂）处理HeLa细胞导致大量核内SNAP-47池的积累，表明SNAP-47在细胞质和细胞核之间穿梭。因此，除了通过促进一部分VAMP的正确定位和功能在膜运输中的作用外，SNAP-47的核定位表明这种SNARE的其他作用——可能在基因表达调控中——有待探索。该研究还揭示了存在一种允许SNAP-47在细胞核和细胞质之间穿梭的机制，涉及CRM1/exportin1依赖性途径。

**2.5 GS28**

高尔基体Qb-SNARE GS28介导ER-高尔基体/高尔基体内囊泡运输，可能在细胞增殖和分化中发挥作用。在一项旨在评估其在宫颈癌组织中表达的研究中，观察到与正常宫颈上皮相比，GS28定位不同，高核表达与晚期肿瘤阶段相关。此外，GS28的高核表达与p53表达呈负相关，而GS28的高细胞质表达与Bcl-2表达呈负相关。进一步分析揭示GS28的高核表达与宫颈癌患者较差的总生存率强烈相关。在没有推定的NLS基序的情况下，GS28存在于宫颈癌细胞核中的机制以及该SNARE在细胞核中的可能功能仍有待阐明。TMD在GS28定位中的潜在作用在该研究中未被探讨。有趣的是，对其果蝇同源物GoS28的表征揭示，在缺乏其TMD的情况下，该SNARE保留了通过与其他膜结合SNARE相互作用促进膜融合的能力。需要进一步研究来加强这项工作的结论，这些结论基于免疫组织化学分析和从组织和细胞系制备的细胞质和核组分的免疫印迹分析。需要进一步研究来理解控制GS28亚细胞定位的机制。

总之，这些研究支持以下概念：一部分SNARE蛋白可以通过包括通过选择性剪接产生可溶性异构体（图1）、受调控的核输入/输出以及潜在的非经典运输途径等机制进入细胞核。这些发现提出了SNARE的核定位构成了一种先前未被充分认识到的基因表达调控机制的可能性。然而，控制核靶向的机制和核SNARE的生理意义仍不完全清楚。

**3 SNARE作为转录因子信号传导和基因调控的调节因子**

**3.1 STXBP6**

Syntaxin结合蛋白6（STXBP6），一种参与SNARE组装的蛋白，在干扰素（IFN）-γ调控PD-L1的背景下被研究。使用过表达STXBP6的人结直肠癌细胞系HCT116和敲低STXBP6的肝癌细胞系Hep2，证明STXBP6负调控IFN-γ诱导的PD-L1表达。分析对IFN-γ响应和对STXBP6抑制敏感的PD-L1启动子元件，鉴定了干扰素调节因子（IRF）-1响应位点。IRF-1是一种定位在细胞质中的转录因子，一部分在IFN-γ响应下转位到细胞核。在暴露于IFN-γ的HCT116细胞中，STXBP6过表达导致IRF-1滞留在细胞质中，而在IFN-γ处理的HepG2 STXBP6敲低细胞中观察到相反的结果。机制上，发现IRF-1和STXBP6可以共免疫沉淀，提示IRF-1与STXBP6的物理相互作用阻止了IRF-1的核转位和IFN信号的异常激活。进一步分析提供证据表明，进入细胞核后，IRF-1结合STXBP6启动子区域并抑制其表达，这与STXBP6下调促进IRF-1核转位以进一步增强对IFN-γ响应的观点一致。最近的研究提供了额外证据表明STXBP6参与细胞代谢过程并在卵巢癌中发挥重编程脂质代谢的作用。这一作用是否涉及与转录因子相互作用的改变是一个值得探索的问题。

**3.2 STX4**

Syntaxin4（STX4）是一种质膜Qa-SNARE，调控向细胞表面的细胞内运输，特别是在葡萄糖转运蛋白GLUT4向质膜的转位中发挥关键作用。STX4的富集被证明通过减少转录因子NF-κB的活化和核转位来改善β细胞功能并预防链脲佐菌素给药引起的高血糖和β细胞死亡。此外，STX4过表达被证明抑制炎症细胞因子刺激β细胞后诱导的NF-κB依赖性趋化因子基因CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达。后续研究揭示STX4通过减弱IκBβ蛋白酶体降解来控制NF-κB信号传导。有趣的是，不可磷酸化的STX4突变体（S78A）在保护IκBβ降解方面比野生型STX4更有效，表明STX4的翻译后修饰可能在其抑制炎症的能力中发挥作用。虽然确切机制仍有待阐明，但提供了STX4与IκBβ和p50-NF-κB相互作用的证据。这些相互作用可能导致减弱促炎细胞因子诱导的IKKβ激活（该激活诱导IκBβ蛋白酶体降解），保护β细胞免受炎症反应。有趣的是，IKKβ还具有IκB磷酸化和NF-κB激活之外的功能。在肥大细胞和血小板中，IKKβ已被证明与SNAP-23结合并磷酸化SNAP-23，这有助于与STX4形成复合物。这种相互作用是否有助于上述STX4依赖性调控IκBβ降解和NF-κB信号传导，或者这些是否代表不同的IKKβ依赖性功能，仍不清楚。这些发现将STX4确定为一种经典质膜SNARE的示例，其可以在不需要直接核定位的情况下调节转录因子信号传导和炎症基因表达。

**3.3 STX6**

Syntaxin 6（STX6）控制反面高尔基体网络和内体区室中的膜运输。由于这种Qc-SNARE在包括肝细胞癌（HCC）在内的多种恶性肿瘤中过表达并参与肿瘤发生和发展，其在HCC中的致癌作用被进一步研究。与STX6在HCC中过表达的观察一致，在Huh7/HepG2细胞中过表达STX6增加了增殖，而在STX6敲低中观察到相反的结果。此外，在肿瘤异种移植模型中，HepG2/Huh7 STX6敲低细胞导致显著更小的肿瘤，表明STX6在体内促进HCC的致瘤行为。进一步分析表明STX6与活化C激酶1受体（RACK1）和信号转导与转录激活因子3（STAT3）相互作用，且在过表达STX6的Huh7/HepG2细胞中STAT3磷酸化增加，表明该SNARE可能通过促进STAT3磷酸化发挥作用，这是触发其核转位和靶基因转录的关键事件。一致地，抑制STAT3活性逆转了STX6过表达对细胞增殖和迁移的影响。因此，STX6通过激活STAT3信号传导和下游基因表达成为HCC发展的促进因子。虽然机制未被研究，但先前证明RACK1介导STAT3募集至胰岛素和胰岛素样生长因子1受体的演示提出了其作为STX6和JAK–STAT通路之间的连接器以促进受体酪氨酸激酶对STAT3磷酸化的可能性。

**3.4 Sec22b**

在JAWSII树突状细胞系和RAW264.7巨噬细胞系中敲低ER-ERGIC R-SNARE Sec22b，揭示了其在调控LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、TNF和IL-6基因表达中的重要作用。进一步分析揭示Sec22b和NF-κB在静息树突状细胞和巨噬细胞的细胞质和细胞核中均共存。LPS刺激后，Sec22b的核定位增加，位于与核仁不同的核区域。共免疫沉淀分析显示，虽然Sec22b和NF-κB共定位，但它们不相互作用，表明NF-κB和Sec22b存在于相同的区室但不形成复合物。这些观察支持以下观点：Sec22b是借助importin促进NF-κB转位的回路的一部分。Sec22b核定位所涉及的机制未被探讨，也没有关于存在缺乏C端TMD的Sec22b异构体的迹象。这些发现进一步支持了囊泡运输机制的组分直接参与涉及炎症基因表达的核信号通路的观点。

**3.5 注意事项与考量**

解释SNARE蛋白相互作用研究时的一个重要考虑是，分离的SNARE基序在缺乏细胞中存在的调控机制时可能表现出混杂的相互作用。特别是，SNARE组装通常由SM蛋白和其他伴侣分子控制，它们帮助促进生产性SNARE复合物的形成并限制不适当的组装。因此，使用分离的SNARE基序、过表达蛋白或在缺乏同源SNARE调控因子的情况下检测到的生化相互作用应谨慎解释，不一定建立生理相关的相互作用或功能性SNARE复合物。未来的研究将相互作用分析与功能缺失方法、内源性蛋白和在适当SNARE调控因子存在下的重构相结合，对于确定这些相互作用在调控基因表达和信号转导功能背景下的特异性和功能相关性将非常重要。

**4 未来方向**

在真核细胞中，基因表达是一个在多个水平上高度协调调控的过程。SNARE参与信号通路控制和定位到细胞核（在那里它们可能与转录因子相互作用）的证据进一步强调了基因表达调控的复杂性（图2）。通过选择性剪接产生缺乏C端TMD的可溶性异构体以及与importin和exportin相互作用所需的NLS或核输出信号的存在，是已描述的SNARE核定位机制的一部分。显然，需要进一步研究来充分阐明SNARE如何进入细胞核。许多未解决的问题仍有待解决。核SNARE功能是否具有细胞类型特异性无疑是一个重要的研究课题，可能需要调查生理和病理条件下各种细胞类型细胞核中存在的SNARE。此类研究还可能导致发现核SNARE特征，可作为癌症或炎症疾病的生物标志物。SNARE如何与信号通路组分相互作用、如何控制转录因子的核转位以及是否与染色质相互作用是值得研究的重要问题，以理解其在基因表达控制中的作用。阐明SNARE依赖性核信号传导的分子机制可能揭示连接膜运输与转录控制的先前未被认识到的调控网络。

**5 结论**

虽然SNARE蛋白因其在介导膜融合中的经典作用而被认可，但越来越多的证据揭示了其在通过调节信号通路、转录调控因子的细胞内运输和直接参与核过程来调控细胞功能方面的未被充分认识的作用。迄今为止描述的机制，包括选择性剪接、受调控的核输入和输出以及与信号传导和转录因子的相互作用，表明SNARE可能通过协调膜运输、信号传导和转录反应来促进细胞稳态的维持。进一步研究这些非经典功能可能在癌症、代谢紊乱和炎症疾病中揭示新的治疗靶点。