《Journal of Thermal Biology》：Oar-miR-411a-5p induces fast-twitch myofibers via the AMPK/PPARGC1A/mitochondria axis in heat-stressed Hu sheep myoblasts
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•Oar-miR-411a-5p 能诱导热应激下的 Hu 羊肌肉母细胞中慢缩肌纤维向快缩肌纤维的转变。•Oar-miR-411a-5p 可激活热应激下的 Hu 羊肌肉母细胞中的 AMPK/PPARGC1A/线粒体轴。•Oar-miR-411a-5p 可抑制热应激下的 Hu 羊肌肉
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Oar-miR-411a-5p 能诱导热应激下的 Hu 羊肌肉母细胞中慢缩肌纤维向快缩肌纤维的转变。
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Oar-miR-411a-5p 可激活热应激下的 Hu 羊肌肉母细胞中的 AMPK/PPARGC1A/线粒体轴。
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Oar-miR-411a-5p 可抑制热应激下的 Hu 羊肌肉母细胞中的糖原生成和糖酵解过程。
引言
全球变暖导致夏季热浪频繁发生，这种持续的高温压力会损害 Hu 羊的生产性能和肉质。Hu 羊是一种在中国东部广泛饲养的本土肉羊品种（Ben Moula et al., 2024; Mirón et al., 2023）。与寒冷季节的压力不同，长期的高温暴露会破坏骨骼肌中的肌肉细胞增殖和分化过程，引发肌内脂质和蛋白质的氧化损伤，并永久改变肌纤维的组成——这些变化最终会导致肉质变差、水分保持能力下降以及风味前体物质的积累减少（Gonzalez-Rivas et al., 2020）。急性屠宰前的热暴露会加速肌内糖原分解和乳酸积累，增加出现肉质苍白、松软（PSE）缺陷肉的可能性；而长期的热暴露则会耗尽肌肉的能量储备，使肌纤维类型偏向于糖酵解型，导致肉质坚韧、缺乏风味（Gregory, 2010）。目前的营养和管理措施可以在一定程度上减轻热应激造成的损失，但在细胞层面，控制热应激下羊肌纤维表型变化的分子机制仍不甚明了，这阻碍了针对耐热性和肉质稳定性的遗传改良。
骨骼肌的技术和感官特性取决于四种肌球蛋白重链（MYHC）异构体的相对丰度：MYHCI 和 MYHCIIa 对应于具有密集线粒体网络的慢氧化型纤维，而 MYHCIIx 和 MYHCIIb 则代表依赖细胞质碳水化合物代谢的快糖酵解型纤维（Picard & Gagaoua, 2020; Schiaffino & Reggiani, 2011）。在生理性的正常体温下，MYHCIIb 的表达与增强的糖酵解通量和降低的线粒体密度密切相关——这一关联已在成熟的反刍动物肌肉组织中得到充分验证（Gong et al., 2023; Lin et al., 2002）。然而，新兴的体外肌肉母细胞研究表明，在热应激下这种固定的代谢耦合会被打破。热暴露会重塑未成熟的肌肉细胞转录网络，产生在完全分化的成年肌肉中未观察到的混合纤维特征（Liu & Brooks, 2012）。AMPK-PPARGC1A 信号轴作为核心的能量感应模块，介导这种表型可塑性（Pan et al., 2025）。Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α（PPARGC1A），如 Ljubicic 等人所述（2011），在肌纤维转化中起着关键作用。作为一种保守的细胞能量传感器，AMPK 的激活可稳定 PPARGC1A，从而启动线粒体生物发生，并将碳代谢途径重新定向为氧化呼吸，这在正常培养条件下通常有利于慢缩肌纤维的成熟（Handschin et al., 2007）。MFN1、MFN2、OPA1 和 DRP1 是线粒体融合和分裂的关键调节因子，它们执行由 AMPK 信号引发的下游代谢重编程（He et al., 2016）。尽管这种级联反应在啮齿动物肌肉中的生理功能已被充分研究，但在热应激下的羊肌肉母细胞中的上游转录后调节因子仍需进一步探索。
微小 RNA（miRNAs）通过转录后抑制目标信使 RNA 来调控肌肉细胞发育和纤维类型转换（Chen et al., 2020）。多种在肌肉中富集的 miRNAs 已在 livestock 模型中得到功能验证：miR-499 和 miR-27a 通过抑制糖酵解相关转录因子来促进慢缩肌纤维的分化，而某些内源性 RNA 则抑制这些 miRNAs 的活性以促进快缩肌纤维的生成（Cai et al., 2022; Ma et al., 2023）。现有的关于羊热应激的 miRNA 研究主要集中在非针对性的转录组筛选上，很少有研究深入解析单个 miRNA 在初级肌肉母细胞中的调节机制（Lu et al., 2024）。对宫内生长受限的 Hu 羊胎儿外泌体的小 RNA 测序发现 oar-miR-411a-5p 是一种在肌肉中普遍存在的 miRNA；后续的细胞实验进一步证实，在慢性热应激下，其表达水平在肌肉母细胞增殖和分化过程中显著下降。对羊、牛和山羊的种子序列进行跨物种比对显示，其功能结合基序完全保守，表明其在反刍动物肌肉稳态中具有保守的调节作用。在羊中，关于 AMPK/PPARGC1A 轴在肌纤维转化中的作用的研究有限，miR-411a-5p 在热应激下的 Hu 羊肌肉母细胞中的具体功能尚未完全阐明。
本研究使用从 Hu 羊中分离出的初级肌肉母细胞构建了一个体外慢性热应激培养系统。通过过表达和敲低内源性 miR-411a-5p 来模拟其效果；通过检测 MYHCI、MYHCIIa、MYHCIIx 和 MYHCIIb 的表达来确定其对慢缩肌纤维和快缩肌纤维形成的影响。同时检测了核心的 AMPK/PPARGC1A 线粒体能量轴以及控制糖酵解和糖原分解的关键酶，目的是阐明 miR-411a-5p 在持续热应激下与肌纤维类型转换之间的完整调控机制，并为本土肉羊的热应激适应提供表观遗传学证据。
章节片段
动物组织样本采集
从中国南京的一个标准化当地屠宰场获取了三只妊娠 90 天的健康 Hu 羊胎儿（平均体重 1.2 ± 0.1 kg）。在无菌解剖条件下，迅速分离了八种类型的组织，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、瘤胃、皱胃和后肢骨骼肌。新鲜的组织块用预冷的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）反复冲洗以去除残留的血液，然后用无菌纸巾擦干。
慢性热应激抑制了 miR-411a-5p 的表达
结果表明，miR-411a-5p 在肾脏中的含量最高，其次是肌肉，而在瘤胃组织中的表达量最低，相比心脏中的表达量更低（P < 0.001，图 1A）。此外，miR-411a-5p 的种子序列在羊、牛和山羊中高度保守（图 1B）。在 Hu 羊肌肉母细胞中，miR-411a-5p 的表达在增殖阶段降低，在分化后 5 天内升高（P < 0.001，图 1C, D）。
讨论
结论
在慢性热应激下，miR-411a-5p 促进快缩肌纤维标记物 MYHCIIb 的转录上调，同时激活 AMPK/PPARGC1A 线粒体信号通路，从而增强氧化器官的重塑并抑制核心糖酵解基因的转录。这种混合表型是由于热应激导致未成熟羊肌肉母细胞中典型的 MYHC 同构体-代谢轴耦合被破坏而产生的，这与正常体温下成熟肌肉中的代谢特征不同。
CRediT 作者贡献声明
Jiawei Lu：撰写初稿、验证、资源准备、正式分析。Huixia Li：撰写、审核与编辑、资金争取
未引用的参考文献
Wang et al., 2024.
伦理声明
本研究符合 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南。该研究已获得动物护理和使用委员会的批准，并得到南京农业大学的认可（批准编号 SYXK-2022-0031）。
数据可用性
数据可在 Mendeley Data 上获取，网址：http://dx.doi.org/10.17632/bby5cdbrys.1。
资金来源
本研究得到了 国家自然科学基金（编号 32172725）和 宁夏自然科学基金（编号 2023AAC02013）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的财务利益或个人关系。
Jiawei Lu|Huixia Li
