UBA1M41突变通过STING-IRF3轴驱动VEXAS综合征I型干扰素信号过度活化及广谱炎症程序

《Leukemia》：Hyperactivation of type I IFN signaling underlies a broad inflammatory program in VEXAS syndrome

　　

VEXAS（Vacuoles, E1 enzyme, X-linked, Autoinflammatory, Somatic）综合征是一种由造血细胞中体细胞UBA1突变引起的严重系统性炎症性疾病。当前治疗方法包括类固醇、IL1、IL6和JAK家族激酶抑制剂、去甲基化药物以及异基因干细胞移植，仅能提供部分且不一致的疾病控制，伴随显著毒性和频繁治疗失败。缺乏持久且耐受性良好的疗法凸显了更好地定义驱动VEXAS综合征的自身炎症机制的必要性。VEXAS综合征患者外周血和骨髓的转录组分析一致显示干扰素（IFN）基因特征的显著上调。连接UBA1突变与IFN失调的分子机制尚不清楚。研究人员先前在32D小鼠髓系细胞系中建立了VEXAS综合征的半合子Uba1^M41L突变敲入模型。RNA测序和基因集富集分析显示，IFNα和IFNγ通路是Uba1^M41L突变细胞中最显著富集的信号特征。转录水平分析表明，与Uba1^WT细胞相比，Uba1^M41L细胞中经典干扰素刺激基因（ISGs）表达升高，研究人员在蛋白质水平上对IRF7、IRF9、STAT2和ZBP1进行了确认。对STAT1（一种位于I型和II型IFN受体下游的转录因子）的检查显示，Uba1^M41L突变细胞在基线时表现出总STAT1和磷酸化STAT1升高，与IFN信号组成性激活一致。用IFNα或IFNγ刺激进一步增强了Uba1^M41L突变细胞相对于Uba1^WT细胞的STAT1磷酸化。过表达具有酶活性的UBA1b，而非催化失活的UBA1b/C632A或荧光素酶，抑制了IFN特征，降低了ISG和STAT1蛋白水平，并使STAT1磷酸化正常化。总之，这些发现表明Uba1^M41L突变驱动UBA1b可逆的IFN过度活化和增加的IFN反应性。I型IFN信号传导涉及JAK1和TYK2，而II型IFN信号传导使用JAK1和JAK2。为了确定介导Uba1^M41L细胞中组成性STAT1磷酸化的激酶，研究人员用ruxolitinib（JAK1/2抑制剂）、upadacitinib（JAK1抑制剂）或deucravacitinib（TYK2抑制剂）处理，所有这些均降低了基础STAT1磷酸化。由于TYK2是I型而非II型IFN信号传导所必需的，deucravacitinib的反应提示I型IFN信号驱动Uba1^M41L细胞中的组成性STAT1磷酸化。为了直接测试这一点，研究人员在Uba1^M41L背景上生成了Ifnar1敲除克隆。IFNAR1缺失消除了IFNα和IFNγ转录特征，并显著降低了STAT1磷酸化和ISG蛋白表达（IRF7、IRF9、STAT1、STAT2、ZBP1）相较于Uba1^M41L亲本细胞；在Tyk2敲除克隆中获得了类似结果。用中和抗体阻断IFNAR1也降低了STAT1磷酸化相较于未处理和IgG对照细胞。为了测试I型IFN信号过度活化是否在人髓系细胞中保守，研究人员通过碱基编辑工程化了携带UBA1^M41T突变的THP1细胞。THP1 UBA1^M41T突变细胞和AAVS1编辑（即UBA1^WT）细胞用anifrolumab（一种单克隆IFNAR1阻断抗体）或同型对照IgG处理，并通过免疫印迹评估。THP1 UBA1^M41T突变细胞表达UBA1a和UBA1c同工型，而对照AAVS1编辑细胞表达UBA1a和UBA1b。在对照IgG处理的样品中，UBA1^M41T突变细胞相对于AAVS1编辑的UBA1^WT细胞表现出降低的多泛素化；UBA1^M41T突变细胞还显示ISGs IRF7、IRF9、STAT1和STAT2的蛋白表达升高以及STAT1磷酸化增加。Anifrolumab阻断IFNAR1降低了UBA1^M41T突变细胞中的STAT1磷酸化并使ISG蛋白水平正常化。总之，这些结果表明I型IFN受体信号对于小鼠和人UBA1^M41突变髓系细胞中的IFN过度活化至关重要。IRF3作为I型IFN反应的中心转录调节因子，作用于模式识别受体信号下游。为了确定IRF3激活是否构成VEXAS综合征32D模型中I型IFN信号增加的基础，研究人员生成了Uba1^M41L/Irf3^KO克隆。全细胞裂解物的免疫印迹分析显示，Irf3缺失消除了升高的STAT1磷酸化并使Uba1^M41L细胞中ISGs IRF7、IRF9、STAT1、STAT2和ZBP1的蛋白水平正常化。值得注意的是，Uba1^WT和Uba1^M41L全细胞裂解物中总IRF3和磷酸化IRF3蛋白水平相似。由于核积累是IRF3激活的标志，研究人员对Uba1^WT、Uba1^M41L和Uba1^M41L/Irf3^KO细胞进行了亚细胞分级分离。研究人员观察到与Uba1^WT细胞相比，Uba1^M41L细胞核组分中总IRF3和磷酸化IRF3的积累增加。磷酸化STAT1也在Uba1^M41L细胞的核组分中富集，而Uba1^M41L/Irf3^KO细胞显示核磷酸化STAT1缺失。恢复UBA1b酶活性足以逆转异常的IRF3和STAT1激活。总之，这些数据表明UBA1b功能丧失驱动Uba1^M41L细胞中失调的IRF3激活和增加的I型IFN信号传导。为了探索IRF3在UBA1突变人类模型中的作用，研究人员使用碱基编辑在THP1细胞中引入UBA1^M41T突变伴或不伴IRF3移码突变。与AAVS1编辑的对照细胞相比，UBA1^M41T细胞显示磷酸化IRF3和STAT1增加以及ISGs IRF7、IRF9、STAT1和STAT2的蛋白表达升高。IRF3编辑细胞如预期缺乏IRF3蛋白。与研究人员在32D Uba1^M41L模型中的观察一致，双UBA1^M41T/IRF3^KO降低了STAT1磷酸化并使ISGs的蛋白表达正常化至AAVS1编辑对照细胞中观察到的水平。总体而言，这些发现表明IRF3对于小鼠和人UBA1^M41突变VEXAS综合征模型中I型IFN信号的过度活化至关重要。泛素依赖性STING降解抑制STING信号传导，而UBA1抑制阻断STING降解并放大I型IFN反应。与UBA1依赖性STING降解受损一致，32D Uba1^M41L细胞中STING蛋白水平升高并通过恢复UBA1b酶活性而正常化。为了测试STING是否驱动I型IFN信号的过度活化，研究人员使用ABE8e在THP1 UBA1^M41T细胞中引入功能丧失性STING突变，相对于AAVS1编辑对照，该突变消除了升高的STING蛋白水平和STAT1磷酸化。通过H-151对STING的药理抑制同样降低了UBA1^M41T细胞中升高的STAT1磷酸化。总之，这些发现表明STING是UBA1^M41突变VEXAS综合征模型中IRF3激活和I型IFN信号增加的上游驱动因子。为了进一步深入了解I型IFN过度活化的下游后果，研究人员使用免疫反应富集分析（IREA）评估了32D Uba1^M41L RNAseq数据中的细胞因子活性特征。IREA利用免疫词典（Immune Dictionary），这是一个涵盖约20种免疫细胞类型对86种细胞因子免疫反应的全面单细胞转录组参考。除IFN特征外，与Uba1^WT细胞相比，Uba1^M41L细胞显示IL1家族和TNFα炎症转录程序的富集。引人注目的是，IL1家族和TNFα特征在IFNAR1和TYK2缺陷的Uba1^M41L细胞中被消除。为了确定这些发现是否延伸到人类疾病，研究人员对一名VEXAS综合征患者在IFNAR1阻断抗体anifrolumab治疗前后进行了血清细胞因子谱分析。在诊断VEXAS综合征之前，该患者有活检证实的、类固醇依赖性亚急性皮肤红斑狼疮，可能是其VEXAS综合征的表现，促使进行了I型IFN阻断的试验。基线血清谱分析显示IFN诱导型趋化因子、IL1β、IL18、TNFα和TNFα诱导型趋化因子升高，与VEXAS综合征中观察到的炎症一致。Anifrolumab耐受良好，难治性皮肤病变在四周内改善；继续治疗12个月清除了皮肤病变并使泼尼松从每日20 mg减至7 mg。在1个月评估时泼尼松未变，此时炎症细胞因子和趋化因子已经下降。在anifrolumab开始后1个月和12个月，IFN通路介质包括CCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11和IFNγ显著降低。IL1家族细胞因子（IL1β和IL18）和TNFα通路介质（CCL2、CCL7、CXCL8和TNFα）也降低，其中几种介质尽管泼尼松减量仍进一步下降。总之，这些数据支持anifrolumab在该患者中具有持久的抗炎和节约类固醇效应，并与研究人员的体外发现即I型IFN通路抑制抑制VEXAS综合征中多种炎症程序相平行。总体而言，研究人员的数据表明STING-IRF3-I型IFN信号轴驱动UBA1^M41突变髓系细胞中的广谱炎症程序。在系统性红斑狼疮患者中，anifrolumab阻断IFNAR1抑制了IFN、IL1家族和TNFα相关转录程序以及IFN诱导型趋化因子、TNFα和IL18的血浆水平，将I型IFN信号定位为人类复杂炎症表型的中心上游驱动因子。结合研究人员的数据，这些观察支持评估anifrolumab作为VEXAS综合征潜在的节约类固醇治疗候选药物，可能避免与JAK抑制剂相关的毒性。I型IFN信号在VEXAS综合征中许可多种炎症程序的机制仍有待确定并值得进一步研究。

**研究背景与科学问题**

VEXAS（Vacuoles, E1 enzyme, X-linked, Autoinflammatory, Somatic）综合征是一种由造血细胞体细胞UBA1突变引起的严重系统性炎症性疾病。当前治疗手段包括类固醇、IL1/IL6/JAK家族激酶抑制剂、去甲基化药物及异基因干细胞移植，但仅能提供部分且不一致的疾病控制，伴随显著毒性和频繁治疗失败。患者外周血和骨髓转录组分析一致显示干扰素（IFN）基因特征显著上调，但连接UBA1突变与IFN失调的分子机制尚不明确。研究人员此前在32D小鼠髓系细胞系中建立了半合子Uba1^M41L突变敲入模型，发现IFNα和IFNγ通路是最显著富集的信号特征。在此基础上，本研究旨在深入解析UBA1突变驱动I型IFN信号过度活化的分子通路及其下游炎症后果，为VEXAS综合征的靶向治疗提供理论依据。

**关键技术方法**

研究人员采用32D小鼠髓系细胞系Uba1^M41L敲入模型和THP1人髓系细胞UBA1^M41T碱基编辑模型，结合RNA测序与基因集富集分析（GSEA）、免疫印迹、亚细胞分级分离、基因敲除（Ifnar1、Tyk2、Irf3、STING）及药理学抑制（ruxolitinib、upadacitinib、deucravacitinib、H-151、anifrolumab）等技术手段，并利用免疫反应富集分析（IREA）评估细胞因子活性特征。此外，对一名VEXAS综合征患者在接受anifrolumab治疗前后进行了血清细胞因子谱分析。

**研究结果**

**UBA1^M41突变通过STING-IRF3轴促进I型IFN信号过度活化**

GSEA显示Uba1^M41L细胞中IFNα和IFNγ通路最显著富集，经典干扰素刺激基因（ISGs）在转录和蛋白水平（IRF7、IRF9、STAT2、ZBP1）均升高。Uba1^M41L细胞基线总STAT1和磷酸化STAT1升高，IFNα或IFNγ刺激后STAT1磷酸化进一步增强。过表达酶活性UBA1b而非催化失活突变体可抑制IFN特征并使STAT1磷酸化正常化，表明UBA1b可逆性调控IFN过度活化。JAK1/2、JAK1及TYK2抑制剂均降低基础STAT1磷酸化，提示I型IFN信号驱动组成性STAT1磷酸化。Ifnar1或Tyk2敲除消除IFNα/IFNγ转录特征并显著降低STAT1磷酸化和ISG蛋白表达。在THP1 UBA1^M41T细胞中，anifrolumab阻断IFNAR1同样降低STAT1磷酸化并使ISG蛋白水平正常化，证明I型IFN受体信号在小鼠和人UBA1^M41突变髓系细胞中均不可或缺。Irf3敲除消除Uba1^M41L细胞中升高的STAT1磷酸化并使ISGs正常化；亚细胞分级分离显示Uba1^M41L细胞核组分中总IRF3和磷酸化IRF3积累增加，磷酸化STAT1核富集在Irf3敲除后消失。THP1 UBA1^M41T/IRF3^KO细胞同样显示STAT1磷酸化降低和ISGs正常化，证明IRF3在两种模型中均为I型IFN过度活化所必需。STING蛋白水平在Uba1^M41L细胞中升高并通过恢复UBA1b活性正常化；THP1 UBA1^M41T细胞中STING功能丧失突变或H-151药理抑制均消除升高的STAT1磷酸化，表明STING是IRF3激活和I型IFN信号增加的上游驱动因子。

**降低I型IFN信号抑制32D Uba1^M41L细胞炎症程序及VEXAS综合征循环炎症介质**

IREA分析显示Uba1^M41L细胞中IL1家族和TNFα炎症转录程序富集，而这些特征在IFNAR1和TYK2缺陷的Uba1^M41L细胞中被消除。一名VEXAS综合征患者接受anifrolumab治疗后，基线升高的IFN诱导型趋化因子、IL1β、IL18、TNFα及TNFα诱导型趋化因子在1个月和12个月时显著降低，皮肤病变清除，泼尼松从每日20 mg减至7 mg，支持anifrolumab持久的抗炎和节约类固醇效应，与体外发现I型IFN通路抑制可抑制多种炎症程序相平行。

**讨论与结论**

研究人员的数据表明STING-IRF3-I型IFN信号轴驱动UBA1^M41突变髓系细胞中的广谱炎症程序。在系统性红斑狼疮患者中，anifrolumab阻断IFNAR1可抑制IFN、IL1家族和TNFα相关转录程序及血浆炎症介质水平，将I型IFN信号定位为人类复杂炎症表型的中心上游驱动因子。结合本研究数据，这些观察支持评估anifrolumab作为VEXAS综合征潜在的节约类固醇治疗候选药物，可能避免与JAK抑制剂相关的毒性。I型IFN信号在VEXAS综合征中许可多种炎症程序的机制仍有待确定并值得进一步研究。