硫酸氧钒通过改变衰老细胞中蛋白质半胱氨酸反应性触发衰老细胞清除并改善衰老相关表型

《Nature Aging》：Altered protein cysteine reactivity in senescent cells is a vulnerability for senolysis to ameliorate aging

　　

饮食如何塑造衰老及以衰老细胞积累为特征的年龄相关疾病仍不清楚。本研究报道，硫酸氧钒（VS）——一种矿物质膳食补充剂——可作为衰老细胞清除剂（senolytic agent）。口服VS可改善雄性小鼠的衰老表型及多种年龄相关疾病，并延长其寿命。整合功能性组学分析显示，衰老细胞整体蛋白质组半胱氨酸反应性降低，但内质网蛋白质稳态所必需蛋白质的表达及其表观半胱氨酸反应性升高。该氧化还原–蛋白质稳态状态与氧化型谷胱甘肽（GSSG）积累相关，并可通过向非衰老细胞递送GSSG重现。机制上，VS使衰老细胞中的反应性半胱氨酸失活并促进二硫键形成，导致蛋白质错误折叠、聚集并最终引起细胞死亡。谷胱甘肽还原酶（GSR）下调促进GSSG积累，从而区分衰老细胞与非衰老细胞，并赋予其对VS的选择性易感性。本研究揭示了衰老细胞可利用的氧化还原–蛋白质稳态脆弱性，具有改善衰老的治疗潜力。

细胞衰老是衰老的标志之一，以持久的细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（SASP）为特征。在衰老过程中，衰老细胞异常积累，形成由SASP驱动的炎症微环境，促进慢性组织损伤并参与肝脏和肺纤维化及动脉粥样硬化等年龄相关疾病的发生。因此，研究人员开发了衰老细胞清除剂（senolytic agents）以选择性清除衰老细胞，作为年龄相关疾病的治疗策略。饮食来源的营养物质不仅提供能量和生物合成原料，还作为调节分子影响人体生理。然而，饮食因素如何影响衰老及年龄相关疾病仍知之甚少，部分原因在于饮食组成和代谢的复杂性。为此，研究人员聚焦于饮食来源的"血液营养物质"，这些物质在循环中相对稳定，易于到达远端器官，并在生理和病理过程中发挥重要作用。研究人员此前构建了市售"血液营养物质"化合物库，包括膳食补充剂、无机物、有机代谢物、肽和脂质。本文中，研究人员通过添加68种膳食补充剂扩展了该资源库，生成扩展版"血液营养物质库+"（blood nutrient library+）。利用该库，研究人员鉴定出矿物质补充剂硫酸氧钒（VS；VOSO?）作为一种意想不到的衰老细胞清除剂，可选择性清除衰老细胞，延长小鼠寿命，同时减轻衰老表型和多种年龄相关疾病。钒是一种膳食微量矿物质，存在于贝类、蘑菇和大豆等食物中，常见+3、+4和+5氧化态，其中+4态最稳定。在VS中，钒以钒氧基离子（VO2?）形式存在，可通过被动扩散或内吞作用进入细胞。VS也是一种非处方膳食补充剂，据报道可在动物模型和2型糖尿病患者中调节葡萄糖代谢并改善胰岛素敏感性。尽管已有这些报道，VS的作用机制仍不清楚。蛋白质半胱氨酸残基是高度反应性的氧化还原敏感位点，可发生亚磺酰化、亚磺酸化、磺酰化和二硫键形成等修饰，作为氧化应激的关键传感器并帮助维持细胞氧化还原稳态。蛋白质错误折叠和聚集通常由内质网（ER）中异常二硫键（S–S）形成触发，其中错配的半胱氨酸产生错误的S–S连接。ER是蛋白质稳态的中心枢纽，协调跨膜蛋白和分泌蛋白的合成、折叠、成熟、稳定和运输。ER蛋白质加工中断导致未折叠或错误折叠蛋白积累，诱导ER应激，最终可导致细胞死亡。除结构作用外，反应性半胱氨酸还作为许多蛋白质（包括蛋白酶、激酶、代谢酶和转录因子）的关键活性或调控位点，支持氧化还原催化、变构调控和金属–配体结合。尽管已在衰老过程中定量绘制了多种小鼠组织中的半胱氨酸氧化还原蛋白质组，但细胞衰老如何重塑蛋白质半胱氨酸反应性以支持衰老细胞存活仍知之甚少。本文中，研究人员研究了VS的抗氧化特性调节半胱氨酸反应性和ER蛋白质稳态以驱动衰老细胞清除的分子机制。

在结果部分，研究人员首先利用扩展的血液营养物质库+进行了两轮筛选，以鉴定选择性诱导衰老细胞死亡同时不伤害非衰老细胞的循环营养物质。在第一轮筛选中，研究人员筛选了选择性杀死多柔比星诱导的衰老人类BJ成纤维细胞而不杀伤非衰老对照BJ细胞的化合物。前16个命中物在第二轮筛选中使用Nutlin3a和RO3306诱导衰老的人类HCA2成纤维细胞进行评估。谷氨酰胺酶抑制剂BPTES作为阳性对照。两轮筛选中，VS均表现出与BPTES相当的衰老细胞清除活性和选择性。研究人员进一步验证发现，衰老BJ和HCA2成纤维细胞以及衰老人类A549肺癌细胞对VS的敏感性高于其非衰老对应细胞。

随后，研究人员在76周龄小鼠中建立了VS的有效体内剂量。口服灌胃34.1 mg/kg，每周三次，持续4周，降低了肾脏中多种衰老相关转录本（包括Cdkn2a（p16）、Il1β和Il6）的水平。因此，研究人员以0.15 mg/ml的浓度通过饮用水给予VS。该剂量低于动物研究中报道的剂量（最高100 mg/kg/天）以及糖尿病患者长期治疗（30个月）所用剂量，后者报道毒性极小。与此一致，饮用VS水13周的小鼠肝脏、肾脏、心脏和脑的H&E染色显示器官异常极小。VS水还减轻了老年小鼠肝脏中年龄相关的细胞质空泡化和肾脏炎症。饮用VS水的老年小鼠体重或瘦体重无显著变化。相比之下，VS水显著改善了悬挂耐力（年龄相关肌肉力量和功能下降的指标）。VS水还以时间依赖的方式减少了脂肪质量积累。与之一致，脂肪组织的H&E染色分析显示脂肪积累减少，包括棕色脂肪组织（BAT）脂肪含量降低以及附睾白色脂肪组织（Epi WAT）和皮下（SQ）WAT平均脂滴面积减小。这些变化伴随着脂肪组织衰老的减少（通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估）。由于年龄相关脂肪积累可损害葡萄糖耐量并促进胰岛素抵抗，研究人员评估了葡萄糖稳态。VS水在葡萄糖耐量试验（GTT）中显著降低了老年小鼠的血糖水平。VS处理的老年小鼠还表现出改善的胰岛素反应。VS水进一步改善了老年小鼠的器官功能。在肝脏中，VS降低了随年龄升高的血清天冬氨酸氨基转移酶（AST），并降低了衰老标志物包括p21蛋白表达和Cdkn2a（p16）、Il1β、Il6、Tnf、Mmp9、Cxcl2和Pai1 mRNA水平。在肾脏中，VS降低了老年小鼠升高的血清尿素水平并减少了肾脏组织中p21蛋白表达。研究人员随后对C57BL/6J雄性小鼠进行了寿命研究，从70周龄开始。小鼠从第500天起接受正常水或VS水3个月并监测生存。VS处理将中位生存期延长至952天，而对照组为886.5天，并显著延长了总体寿命。4周VS灌胃方案也观察到类似益处。相比之下，口服VS未显著改变老年小鼠肠道微生物组多样性或总体分布模式。为评估VS的年龄特异性效应和持久性，研究人员纳入了额外的VS处理年轻小鼠组和老年VS撤药组。饮用水给予VS产生约300 μg/l（约5.9 μM）的血清钒水平，与细胞培养所用浓度相当。6周后，小鼠被分配到VS维持组或VS撤药组，停药后血清钒恢复至基线。VS改善了老年小鼠的肌肉耐力并减少了脂肪质量积累而不影响瘦体重，但对年轻小鼠无影响。这些益处在撤药后基本维持。VS未改变总体水、体重、食物摄入或水摄入。VS改善了老年小鼠的葡萄糖耐量，对年轻小鼠无影响，且该益处在撤药后持续存在。VS处理和撤药还减少了SA-β-gal染色并改善了年龄相关的肝脏空泡化和肾脏炎症。这些结果支持VS的年龄选择性效应，并表明其益处在治疗停止后可持续存在，为脉冲给药（on–off）方案提供了依据。为测试这些效应是否可延伸至雌性，老年雌性小鼠接受VS处理3个月。VS同样改善了肌肉耐力和代谢参数并减少了衰老细胞负荷，与雄性中观察到的效应一致。总体而言，这些结果表明口服VS在小鼠中作为衰老细胞清除剂发挥作用，改善雄性和雌性小鼠的多种年龄相关生理表型，并显著延长寿命。

在年龄相关疾病方面，研究人员首先使用瘦素受体缺陷的db/db C57BL/6小鼠（2型糖尿病模型）检查VS对糖尿病的作用是否涉及衰老细胞清除活性。口服VS 4周显著降低了db/db小鼠GTT期间的血糖。该改善伴随着脂肪组织衰老的减少（SA-β-gal染色评估）以及脂肪组织中Cdkn1a（p21）和Cdkn2a（p16）mRNA水平的降低。这些结果支持VS对糖尿病代谢表型改善的衰老细胞清除贡献。研究人员接下来在由胆碱缺乏L-氨基酸定义的高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）引起的肝纤维化中评估VS。与饲料喂养对照相比，高脂喂养小鼠显示肝脏脂滴面积显著增加和肝脏纤维化加重（Masson三色染色评估）。这些变化伴随着肝脏甘油三酯水平升高、胶原基因（col1a1、col3a1、col4a1）和NASH生物标志物Cxcl10以及衰老标志物Cdkn1a（p21）和Cdkn2a（p16）表达增加。相比之下，口服VS 4周减少了肝脏脂质积累和纤维化，降低了甘油三酯水平并降低了这些分子标志物的mRNA水平，表明VS改善NASH相关肝脏病理。研究人员还评估了腹腔注射四氯化碳（CCl?）诱导的肝毒素驱动肝纤维化模型。与对照小鼠相比，CCl?处理小鼠出现显著增加的肝纤维化（Masson三色染色评估）并伴有肝脏p21蛋白水平升高，与衰老增加一致。VS给药显著减轻了这些表型，减少了肝纤维化和损伤。研究人员接下来在载脂蛋白E缺陷（ApoE?/?）小鼠中评估VS对动脉粥样硬化的作用，这些小鼠喂食补充胆固醇的高脂致动脉粥样硬化饮食。与正常饮食野生型小鼠相比，致动脉粥样硬化饮食ApoE?/?小鼠出现显著增加的主动脉动脉粥样硬化病变（Sudan IV阳性富脂斑块评估）以及血清总胆固醇升高。VS处理减少了ApoE?/?小鼠主动脉斑块负荷和血清总胆固醇水平，表明VS减轻小鼠动脉粥样硬化表型。在通过气管内滴注博来霉素（Bleo）诱导的肺纤维化模型中，口服VS处理改善了生存率和Bleo后体重恢复。VS还减轻了肺纤维化，表现为全肺匀浆中肺胶原含量的显著减少。与之一致，VS处理的Bleo小鼠肺中胶原基因和衰老标志物Cdkn1a（p21）和Cdkn2a（p16）的mRNA水平降低。

为确定VS触发衰老细胞死亡的途径，研究人员测量了VS处理的衰老BJ细胞中多种细胞死亡程序的生物标志物。自噬在VS暴露后6至36小时持续强烈诱导，而凋亡在较晚时间点（24至36小时）变得显著。焦亡也在24至36小时增加，而坏死性凋亡、铁死亡和parthanatos的标志物变化较小。这些数据表明VS诱导的衰老细胞死亡主要由持续自噬驱动，凋亡作为下游事件在后期出现。为阐明VS衰老细胞清除活性的机制，研究人员设计了一个时间序列整合机制框架来分析衰老BJ细胞中VS的响应。具体而言，研究人员进行了（1）kethoxal辅助单链DNA测序（KAS-seq；20分钟至2小时）以捕获VS对全局转录动态和增强子活性的最早效应，（2）磷酸化蛋白抗体阵列分析（2–24小时）以确定早期信号变化，（3）RNA测序（RNA-seq）（24小时）以分析持续的转录组重塑。KAS-seq数据的功能富集显示VS处理后ER应激相关基因快速诱导，以及参与ER相关蛋白降解和蛋白酶体蛋白分解代谢的途径。这些转录变化与磷酸化蛋白抗体阵列检测到的早期信号事件一致，包括VS处理后2小时即出现ER应激相关蛋白（如p-JNK和p-ULK1）磷酸化增加。RNA-seq进一步显示非衰老细胞无论VS处理如何均聚集在一起，而衰老细胞显示独特的VS诱导转录响应。该模式表明VS对非衰老细胞影响极小但选择性重编程衰老细胞。此外，RNA-seq数据的基因本体（GO）富集和全局基因集富集分析（GSEA）进一步显示VS主要上调富集于ER应激、蛋白酶体和溶酶体介导的降解以及自噬的基因。相反，VS下调富集于细胞周期、细胞分裂和增殖以及MAPK信号的基因集。

研究人员接下来检查了VS处理后未折叠蛋白反应（UPR）的激活。VS处理在非衰老细胞中诱导最小的UPR激活（除短暂的ATF4增加外），而在衰老细胞中强烈激活UPR途径，表明衰老细胞中存在选择性蛋白质稳态脆弱性。基于这些发现，研究人员检查了VS诱导的ER应激是否反映蛋白质折叠稳态的破坏并导致蛋白质聚集。这种蛋白毒性应激也已知会升高自噬和蛋白酶体及溶酶体依赖的降解以清除错误折叠蛋白和聚集体，这可能最初保护衰老细胞。研究人员假设一旦VS诱导的应激超过这些适应性途径的能力，细胞将经历衰老细胞清除和死亡。与该模型一致，抑制蛋白质稳态途径进一步加剧了VS细胞毒性：蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（BafA1）或溶酶体蛋白酶抑制剂E64均进一步降低了VS处理的衰老BJ细胞的活力。这些结果表明VS诱导的自噬、蛋白酶体活性和溶酶体功能增加作为衰老细胞中的保护性响应。相反，用毛喉素和西地那非激活蛋白酶体显著挽救了VS处理的衰老BJ细胞降低的活力。此外，VS选择性诱导衰老细胞中的蛋白质聚集。AggStain荧光（蛋白质聚集体的非共价传感器）在VS处理后随时间在衰老BJ细胞中增加而在非衰老细胞中不增加。与之一致，VS还增加了衰老BJ细胞中LysoTracker染色强度并增强了DQ-BSA降解（反映溶酶体蛋白水解活性），伴随着细胞尺寸减小。总之，这些发现表明VS诱导的蛋白质稳态应激和蛋白质聚集超过衰老细胞的适应能力，最终驱动衰老细胞清除。

由于VS中的钒可作为半胱氨酸氧化剂共价攻击半胱氨酸并促进半胱氨酸氧化（包括决定蛋白质折叠的二硫键形成），研究人员检查了抗氧化剂是否能挽救VS处理的衰老细胞。研究人员测试了含硫醇基团的N-乙酰半胱氨酸（NAC）和不含硫醇基团的Trolox。尽管两种化合物在VS处理的衰老BJ细胞中将活性氧降低至相当水平，但只有NAC恢复了细胞活力。使用衰老HCA2和A549细胞获得了类似结果。与之一致，NAC而非Trolox还逆转了VS诱导的LC3-II升高、蛋白质聚集和LysoTracker阳性细胞器积累及细胞尺寸减小。NAC而非Trolox的选择性挽救支持半胱氨酸氧化作为VS诱导蛋白质错误折叠和衰老细胞清除的机制。质谱进一步证实VS促进二硫键形成：在生理条件下与NAC共孵育产生NAC二硫化物产物，并观察到还原型谷胱甘肽（GSH）向氧化型谷胱甘肽（GSSG）的类似氧化。为直接评估VS对半胱氨酸反应性的影响，研究人员将VS与含有CXXC基序（经典活性位点二硫键序列）的合成肽孵育。研究发现VS促进这些氧化还原活性半胱氨酸处的二硫键形成，而对已处于氧化二硫键形式的对照肽无影响。此外，VS诱导衰老BJ细胞中表达的遗传编码氧化还原传感器Grx1-roGFP1的氧化，表明细胞内二硫键形成，而该效应被NAC而非Trolox消除。为区分VS与非选择性半胱氨酸靶向剂，研究人员将其效应与N-乙基马来酰亚胺（NEM，一种成熟的半胱氨酸烷基化剂）进行比较。与VS不同，NEM同等降低非衰老和衰老BJ细胞的活力，表明VS通过二硫键形成介导半胱氨酸氧化而非 indiscriminate 半胱氨酸修饰。

为评估VS是否影响非衰老与衰老细胞的全蛋白质组半胱氨酸反应性，研究人员进行了基于凝胶的活性蛋白质谱分析（ABPP）。凝胶内荧光成像显示BJ或HCA2细胞中衰老诱导相对于非衰老对照降低了总体半胱氨酸反应性。VS处理进一步降低了衰老细胞中的半胱氨酸反应性但对非衰老细胞影响极小。NAC而非Trolox恢复了衰老细胞中的蛋白质组半胱氨酸反应性。总之，这些数据表明衰老细胞的特征是整体降低的半胱氨酸反应性，可能反映紊乱的氧化还原状态，这可能有助于其对VS介导的半胱氨酸氧化的选择性易感性。为全面定量绘制衰老诱导过程中半胱氨酸反应性变化，研究人员使用基于二甲基标记的ABPP对衰老诱导前（第0天）和衰老诱导后（第8天）的BJ细胞进行分析。整合两个实验批次，研究人员定量了1,418种蛋白质用于衰老相关表征。定量分析显示多柔比星诱导的衰老伴随着BJ细胞中半胱氨酸反应性的整体降低，导致完全衰老状态下反应性半胱氨酸的显著丢失。为探究半胱氨酸在衰老诱导中的生理相关性，研究人员使用聚类和富集分析联合分析了半胱氨酸反应性和相应蛋白质丰度的变化。尽管全蛋白质组半胱氨酸反应性整体降低，但一个独特的蛋白质子集显示半胱氨酸反应性增加。GO分析显示蛋白质折叠因子强烈富集。这些蛋白质主要定位于ER，包括ERO1α和多个蛋白质二硫键异构酶（PDI）家族成员。PDI在蛋白质折叠过程中催化硫醇–二硫键交换，而ERO1重新氧化PDI。与这些分析一致，研究人员验证了衰老BJ和HCA2细胞中ERO1α、PDIA1、PDIA3、PDIA4和PDIA6的半胱氨酸反应性和蛋白质水平相对于匹配对照均升高。与衰老细胞的发现一致，老年人类供体原代肝组织中全蛋白质组半胱氨酸反应性相对于年轻供体显著降低。老年供体肝脏中ERO1α、PDIA1和PDIA6的蛋白质水平也升高。研究人员在老年与年轻小鼠原代组织中观察到类似模式，肝脏、肺和肾脏中显示整体降低的半胱氨酸反应性以及ERO1α和多个PDI表达升高。在疾病模型中也检测到类似变化，包括NASH相关肝纤维化或肺纤维化小鼠与正常对照相比。此外，口服VS有效逆转了老年小鼠（80周）肝组织中相对于载体处理对照升高的ERO1α和多个PDI蛋白质水平，并类似降低了VS处理的db/db糖尿病小鼠脂肪组织中的这些蛋白质。总之，衰老细胞和衰老组织显示整体降低的半胱氨酸反应性但ER蛋白质折叠因子的表达和表观半胱氨酸反应性增加，可能创造对VS的脆弱性。通过支持强大的ER蛋白质稳态，这些变化可能促进旺盛的SASP产生和分泌，并可能为VS诱导衰老细胞清除创造可利用的靶点。

研究人员试图全面定量绘制衰老细胞中VS敏感的半胱氨酸位点。研究人员使用简化半胱氨酸（SLC）-ABPP在短期VS暴露后（在继发性蛋白质稳态重塑和蛋白质聚集发生之前）捕获直接和快速的VS响应半胱氨酸靶点。重复分析显示高重现性。在整个数据集中，研究人员绘制了来自4,801种蛋白质的11,946个半胱氨酸位点。其中，来自880种蛋白质的1,044个半胱氨酸显示时间依赖性反应性降低。研究人员鉴定了11个半胱氨酸残基在20分钟后即对VS具有高置信度优先敏感性（比值<0.8）。研究人员验证了AP2M1（衔接蛋白复合物2的亚基，与LC3相互作用并促进自噬）作为顶级VS响应命中物。VS处理后，AP2M1 C337处的半胱氨酸反应性在20分钟时瞬时降低但在60分钟时恢复，表明AP2M1是早期VS靶点。C337是已报道的S-亚硝基化位点，与其高反应性和VS敏感性一致。由于AP2M1通过LC3依赖的自噬促进claudin-2降解，研究人员测试了VS是否通过C337修饰而非破坏AP2M1功能发挥作用。C337替换（C337A、C337S或C337D）未损害AP2M1功能，表明C337对生理活性是非必需的。然而，野生型AP2M1而非C337突变体部分保护细胞免受VS诱导的衰老细胞清除并在VS处理后优先聚集。总之，这些结果支持研究人员的模型，即VS广泛作用于反应性半胱氨酸残基以破坏蛋白质稳态，AP2M1代表早期VS响应的半胱氨酸氧化靶点而非衰老细胞清除的中心介质。研究人员假设除早期靶向功能性半胱氨酸外，VS可能最终通过由错配半胱氨酸硫醇触发的错误折叠引起的蛋白质聚集体进行性积累驱动衰老细胞清除。为测试这一点，研究人员系统分析了VS暴露后期从衰老细胞中分离的蛋白质聚集体。全细胞裂解物平行处理以定量总蛋白质水平。总共，研究人员从衰老细胞中定量了3,730种蛋白质（聚集体组分中1,760种，全细胞裂解物中3,501种）。VS诱导聚集蛋白质的时间依赖性增加，伴随着全细胞裂解物中总蛋白质丰度的降低，而非衰老细胞显示极小变化。这些结果与研究人员早期观察一致，即VS选择性促进衰老细胞中的蛋白质聚集，伴随着增加的蛋白酶体和溶酶体活性及减少的细胞内容物。此外，VS处理6小时或12小时的衰老BJ细胞聚集体的定量分析显示不同的积累模式。在6小时，GO分析显示聚集体中富集参与翻译和胞质核糖体的蛋白质，表明VS最初扰乱衰老细胞中的全局蛋白质合成。到12小时，聚集体组成转向ER蛋白质折叠因子，ERO1α和多个PDI特定富集，伴随着全细胞裂解物中这些蛋白质总水平的降低。与这一时间转换一致，BJ细胞中ERO1α、PDIA1、PDIA3、PDIA4和PDIA6的半胱氨酸反应性在VS处理后维持至6小时但在12小时降低。为确定异常二硫键形成是否促进蛋白质聚集，研究人员进行非还原SDS–PAGE以评估聚集蛋白质组学鉴定的顶级候选蛋白质中的二硫键形成。在非还原条件下，VS处理显著增加了PDI家族成员和ERO1α的高分子量物种（黑色箭头所示）。这些条带可被β-巯基乙醇（βME）处理消除，表明它们代表βME敏感的、二硫键连接的物种而非非共价聚集体。总之，这些分析支持一个两阶段模型，其中早期VS暴露靶向超敏感半胱氨酸如AP2M1 C337，而延长暴露 increasingly 靶向ER折叠蛋白如ERO1α和PDI，促进其聚集和衰老细胞死亡。

为研究衰老诱导改变衰老细胞中半胱氨酸反应性的机制，研究人员检查了GSH/GSSG比值，这对细胞氧化还原稳态和ER氧化蛋白折叠至关重要。鉴于VS处理的衰老细胞聚集体中鉴定的错误折叠蛋白主要是ER蛋白，研究人员测量了衰老细胞中GSH和GSSG的水平。研究人员发现衰老HCA2和BJ细胞中降低的GSH/GSSG比值仅由异常GSSG积累驱动，而GSH水平在BJ细胞中保持不变或在HCA2细胞中甚至增加。研究人员接下来询问GSSG积累是否足以在非衰老细胞中赋予衰老相关表型。通过脂质体向非衰老BJ细胞递送GSSG导致GSSG积累而不改变GSH水平。GSSG脂质体处理的非衰老BJ细胞的半胱氨酸反应性分析显示半胱氨酸反应性整体降低，并被VS进一步增强。相比之下，蛋白质折叠因子包括ERO1α和多个PDI显示表达和表观半胱氨酸反应性增加，类似于衰老诱导期间观察到的变化。在衰老和GSSG处理细胞之间共享的增加半胱氨酸反应性的98种蛋白质中，蛋白质折叠因子包括ERO1α和PDI显著富集。GSSG脂质体处理的非衰老BJ细胞中蛋白质折叠相关蛋白的mRNA水平升高得到进一步验证。此外，RNA-seq结果的GSEA分析显示GSSG脂质体处理非衰老BJ细胞上调ER蛋白质加工途径的基因集，ERO1α和多个PDI在改变基因之列，以及细胞衰老。RT–PCR进一步证实GSSG脂质体处理的非衰老BJ细胞中SASP基因的广泛诱导。GSSG处理在非衰老细胞中诱导增加的SASP表达，伴随着类似于衰老诱导期间观察到的半胱氨酸反应性重塑模式。这些发现表明GSSG积累可促进关键衰老相关特征并可能改变细胞硫醇缓冲能力，创造可被VS利用以诱导衰老细胞清除的氧化还原环境。GSSG处理未升高p16或p21表达，表明其单独不足以完全诱导细胞衰老。与该发现一致，向非衰老细胞递送GSSG减少了细胞数量，并被VS进一步降低。此外，GSSG递送使非衰老BJ细胞对VS处理敏感，表现为增加的蛋白质聚集体和溶酶体丰度及活性。相比之下，GSSG递送未使非衰老BJ细胞对对照衰老细胞清除剂谷氨酰胺酶抑制剂BPTES敏感，表明GSSG特异性使非衰老细胞对VS处理敏感。机制上，虽然VS未影响非衰老BJ细胞中Grx1-roGFP1蛋白（ER靶向氧化还原探针）的氧化，但GSSG递送增加了VS处理的非衰老细胞中Grx1-roGFP1蛋白的氧化及二硫键形成。与该发现一致，在非衰老细胞中，GSSG单独诱导UPR和自噬的激活，并在GSSG预处理24小时后被VS进一步增强。在此背景下，抑制UPR（GSK2606414）或自噬（BafA1）进一步增强了VS诱导的细胞死亡，表明这两种途径均作为细胞保护性响应。此外，GSSG脂质体递送使非衰老BJ细胞对VS诱导的蛋白质聚集体积累敏感，其中检测到多种PDI。总之，研究结果表明GSSG的异常积累有助于衰老相关特征并启动衰老细胞对VS诱导的衰老细胞清除的敏感性。为研究GSSG积累的基础和衰老细胞中潜在的代谢脆弱性，研究人员比较了三种独立衰老模型中GSSG–GSH互变途径核心酶的表达和酶活性。谷胱甘肽还原酶（GSR）表达和酶活性一致降低，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）家族成员显示异质性转录变化且总活性无一致变化。这些发现在体内得到验证，老年小鼠肝脏和肾脏分离的衰老细胞中Gsr mRNA显著降低而GPx基因保持可变。总之，这些数据表明衰老细胞中降低的GSR活性在限制GSSG还原为GSH方面起主要作用，导致GSSG积累。此外，GSR的药理学抑制（2-AAPA）单独诱导GSSG积累并使细胞对VS诱导的细胞死亡敏感。该效应被增强GPx活性的亚硒酸钠共处理进一步增强。与该结果一致，GSR的遗传敲低增加了GSSG水平并赋予VS敏感性。总之，这些结果确定了一个衰老相关轴，其中GSR下调驱动GSSG积累，从而区分衰老与非衰老细胞并赋予对VS的选择性易感性。

在讨论部分，研究人员指出，本研究鉴定了整体降低的半胱氨酸反应性以及ER蛋白质折叠蛋白增加的反应性和表达，作为衰老细胞以前未被认识的特征。这些变化与GSR表达降低和GSSG积累相关，赋予对VS的选择性敏感性。AP2M1 C337被鉴定为早期VS响应半胱氨酸位点，野生型AP2M1而非C337突变体的过表达部分挽救了VS诱导的细胞死亡，支持该位点的贡献性而非主导性作用。更广泛地，对VS的选择性敏感性可能源于衰老细胞富含GSSG的氧化还原状态，这有利于钒介导的半胱氨酸氧化、二硫键形成以及随之而来的蛋白质错误折叠和聚集。相比之下，其他衰老细胞清除剂通过不同机制发挥作用，包括BPTES的谷氨酰胺酶抑制和HSP90抑制剂的PI3K/AKT途径抑制。总之，本研究为VS的衰老细胞清除和抗衰老效应提供了机制解释。美国成年人膳食补充剂使用自1970年代以来稳步增加。本研究提供了膳食补充剂如何影响衰老相关生理的机制示例。由于升高的GSSG/GSH比值与包括糖尿病在内的慢性疾病相关，研究结果支持在此类疾病背景下进一步评估VS。衰老细胞中降低的GSH/GSSG比值主要由GSSG积累驱动，而GSH维持或增加，可能反映补偿性GSH产生。在衰老细胞中，GSR下调和GSSG积累损害硫醇氧化还原缓冲并改变半胱氨酸可及性，增加蛋白质组脆弱性和对VS的敏感性，而非衰老细胞保留更大的维持氧化还原平衡的能力。GSSG递送增加ER蛋白质折叠蛋白包括ERO1α和多种PDI的表达和半胱氨酸反应性的发现，突出了ER蛋白质稳态在衰老诱导和衰老细胞功能中以前未被充分认识的作用。然而，该过程如何被调控以及如何支持衰老细胞存活仍不清楚。未来研究需要确定GSSG积累如何协调SASP和ER蛋白质折叠因子的表达以促进衰老并支持衰老细胞功能和存活。尽管VS改善了两种性别的衰老相关表型，但其对雌性小鼠寿命的影响以及雄性小鼠寿命延长的潜在机制仍不清楚。尽管糖尿病患者长期VS治疗在临床试验中显示疗效且毒性有限，但过量钒暴露可导致有害效应，包括肺功能损害并最终肺纤维化，且更多氧化形式钒（+5）据报道在体外诱导成纤维细胞衰老。与V?O?直接与GSH反应生成GSSG并降低GSH/GSSG比值不同，VS不在细胞中诱导GSSG积累而是利用预先存在的富含GSSG的氧化还原状态。此外，VS诱导的DNA损伤据报道在显著更高浓度（>100 μM）下发生，表明本研究中观察到的效应不太可能主要由基因毒性驱动。尽管如此，全面评估潜在毒性，特别是在长期暴露条件下，将是充分确定VS安全性特征所必需的。研究结论为：本研究揭示了衰老细胞整体降低的半胱氨酸反应性以及ER蛋白质折叠蛋白增加的反应性和表达，这些变化与GSR表达降低和GSSG积累相关，赋予对VS的选择性敏感性，揭示了衰老细胞可利用的氧化还原–蛋白质稳态脆弱性，具有改善衰老的治疗潜力。