《Cancer Medicine》：Can Multiparametric Digital Whole-Slide Image Analysis Improve Recurrence Risk Stratification in Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma?
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口腔舌鳞状细胞癌（TSCC）的复发仍是预后判断的难题，亟需反映肿瘤生物学特征的补充性预后评估方法。因此，研究人员构建了一个客观、观察者无关的多参数模型，整合了肿瘤 compartment 与间质 compartment 的特征。研究纳入80例TSCC患者的数字
口腔舌鳞状细胞癌（TSCC）的复发仍是预后判断的难题，亟需反映肿瘤生物学特征的补充性预后评估方法。因此，研究人员构建了一个客观、观察者无关的多参数模型，整合了肿瘤 compartment 与间质 compartment 的特征。研究纳入80例TSCC患者的数字化全切片图像（WSI），采用半自动与深度学习相结合的方法进行分析。研究人员提取了定量组织形态学特征，包括肿瘤/间质比（TSR）、肿瘤间质内淋巴细胞/间质细胞比（LSCR）以及反映肿瘤不连续性的改良Polsby-Popper（MPP）评分。通过组织微阵列（TMA）取样，对中央区及浸润前沿肿瘤区域的人滋养层细胞表面糖蛋白（Trop-2）表达进行免疫组织化学评估，并以H-score定量。通过汇总上述参数的得分构建复合评分（CS）；由于Trop-2未能改善交叉验证的区分度，最终采用由TSR、LSCR、MPP组成的三标志物CS作为最终模型。患者被分层为不同预后组，并分析无复发生存期（RFS）。虽然单个参数仅显示趋势，但CS将患者分为预后不良、中等和良好三组，5年RFS概率分别为64.6%、75.3%和100.0%。重复五折交叉验证获得的交叉拟合共识一致性指数为0.587（每次重复的平均一致性指数为0.567 ± 0.039），而表观一致性指数为0.676，与传统预后因素相比无差异证据。在探索性多变量Firth惩罚Cox回归中（校正pT3–pT4a类别），预后良好组相比预后不良组显示更低的复发风险（HR 0.104，95% CI 0.001–0.854，p = 0.0316）；该未经交叉验证的估计因预后良好组样本量小且无复发事件而较为脆弱。这种观察者无关的全切片图像方法可能为常规组织学特征提供补充性预后信息，但需外部验证。
口腔鳞状细胞癌（OSCC）的复发是决定患者预后的主要因素，文献报道复发率可高达45%，生存率可能从92%下降至30%。治疗包括原发肿瘤手术切除联合同侧或双侧颈淋巴结清扫及缺损重建，随后根据特定临床病理标准辅以放疗（化疗）。导致肿瘤复发的因素可分为与手术操作相关的方面（尤其是切缘状态）以及反映肿瘤生物学的方面（如神经周围侵犯、血管侵犯和淋巴血管侵犯）。然而，超过半数标本中这些特征可能缺失。这提出了寻找额外组织生物标志物以应对常规参数缺失病例的需求，前提是该亚组患者可能并非遵循统一预后。
在此背景下，研究人员此前开发了改良Polsby-Popper（MPP）评分，这是一种观察者无关的定量组织学参数，用于评估肿瘤生长模式，在舌鳞状细胞癌（TSCC）数字化苏木精-伊红（H&E）全切片图像（WSI）上测量。研究表明，尤其在pT1–pT2期TSCC中，MPP评分在预测总生存和肿瘤特异性生存方面优于肿瘤分级，而分级在肿瘤复发中的作用仍存在争议。然而，单独MPP评分无法可靠预测TSCC复发。其他研究者的既往工作逐项探讨了肿瘤生长模式、肿瘤间质的数量与组成以及肿瘤浸润淋巴细胞在间质区室中的作用，或将它们与常规组织形态学特征联合分析。此外，特定免疫组织化学标志物的作用也受到研究关注。人滋养层细胞表面糖蛋白（Trop-2）已成为OSCC中潜在相关的复发生物标志物。研究人员此前的研究表明，Trop-2的特定空间表达模式与无复发生存期受损显著相关，将其确定为独立预后因素。此外，Trop-2靶向治疗在晚期头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中已显示临床获益，即使在重度经治患者中亦有效。然而，由于所研究的因素多样，TSCC肿瘤学结局的预测仍具挑战性和争议性。
本研究旨在开发一种整合性、定量、观察者无关的多参数方法，综合考虑肿瘤和间质区室的特性以及特定Trop-2免疫组织化学特征，在部分可自动化的计算病理学框架下检查数字化TSCC全切片图像，以加深对TSCC复发的理解。
研究人员开展的研究及结论：研究人员利用80例TSCC患者的数字化WSI，通过半自动和深度学习相结合的方法提取TSR、LSCR和MPP评分，并通过TMA评估Trop-2表达，构建了包含TSR、LSCR和MPP的三标志物复合评分。研究发现，单个参数仅显示趋势，但复合评分可将患者分层为预后不良（≤4分）、中等（5分）和良好（≥6分）三组，5年RFS分别为64.6%、75.3%和100.0%。交叉验证后一致性指数为0.587，与传统预后因素无显著差异。探索性多变量分析中预后良好组复发风险显著低于预后不良组（HR 0.104，p = 0.0316），但该估计未经交叉验证且预后良好组样本量小。研究表明，这种观察者无关的全切片图像方法可能为常规组织学特征提供补充性预后信息，但需外部验证。其重要意义在于为常规高风险特征缺失的TSCC患者提供了一种基于全切片图像的客观预后分层工具。
关键技术方法概述：研究人员采用半自动图像分析工作流在QuPath软件中标注肿瘤和间质区室并提取面积和周长测量值；开发了基于EfficientNet-B0编码器和U-Net架构的深度学习分割模型实现肿瘤组织自动分割；使用QuPath内置细胞检测功能进行间质细胞检测和两层分类（淋巴细胞与 resident 间质细胞）；构建组织微阵列（TMA）进行Trop-2免疫组织化学染色并以H-score定量；采用重复五折交叉验证（200次重复）评估模型区分度，并使用Firth惩罚Cox回归进行多变量生存分析。研究队列来源于2007至2019年间在德国埃尔朗根大学医院耳鼻咽喉头颈外科接受根治性手术的pT1–pT4a期活动舌鳞状细胞癌患者，最终纳入80例具有完整临床、组织病理学、图像衍生和随访数据的患者。
研究结果：
3.1 临床病理与治疗特征：研究纳入80例患者，中位年龄64.5岁，男性50例（62.5%），女性30例（37.5%）。19例（23.8%）发生肿瘤复发，中位复发时间367天。76例（95.0%）为R0切除。大多数患者为pT1–pT2期（78.8%）。
3.2 图像分析结果：中位TSR为24.54%，中位LSCR为74.05%，中位MPP评分为2.58。中央区Trop-2 H-score中位值为173.75，浸润前沿为176.25。半自动TSR与病理学家估计呈强相关（Spearman ρ = +0.90，p < 0.001）。半自动与机器学习分割计算的MPP评分高度相关（ρ = +0.89，p < 0.001）。TSR与淋巴细胞密度无显著相关（ρ = ?0.09，p = 0.433），支持将二者作为独立变量。浸润前沿Trop-2 H-score在不同肿瘤分级间存在显著差异（Kruskal-Wallis p = 0.024），G3高于G2（Dunn事后检验，Holm校正p = 0.020）。
3.3 无复发生存分析：pT类别与RFS显著相关（pT1–2 vs pT3–4a，log-rank p = 0.015）。肿瘤厚度和肿瘤分级与RFS无显著相关（分别为p = 0.641和p = 0.374）。使用数据衍生截断值，TSR与RFS无显著相关（p = 0.114），LSCR显示改善RFS的趋势但未达统计学显著性（p = 0.052），MPP评分与RFS无显著相关（p = 0.171）。中央区Trop-2表达显示改善RFS的趋势但未达显著性（p = 0.056），浸润前沿Trop-2表达与RFS无关（p = 0.336）。
3.4 复合评分对RFS的影响：研究人员最初尝试构建包含TSR、LSCR、MPP和Trop-2的四变量复合评分。加入中央区或浸润前沿Trop-2表达均未改善区分度（交叉拟合共识一致性指数分别为0.580和0.593，三标志物模型为0.587和0.606）。最终采用三标志物复合评分，范围3–6分。复合评分与pT类别显著相关（Kruskal-Wallis p = 0.005），与肿瘤厚度显著相关（Mann-Whitney p = 0.022）。患者被分层为预后不良（≤4分）、中等（5分）和良好（≥6分）三组。全局log-rank检验p = 0.047，预后不良组与良好组之间差异显著（未校正p = 0.0164；Holm校正p = 0.0492）。5年RFS分别为64.6%、75.3%和100.0%。置换检验结果一致（10,000次迭代；p = 0.0494）。交叉拟合共识一致性指数为0.587，200次重复的平均每次重复一致性指数为0.567 ± 0.039。与传统预后因素相比无差异证据（肿瘤分级c-index 0.605，Δc = ?0.018；pT类别0.624，Δc = ?0.037；肿瘤厚度0.564，Δc = +0.023）。在Firth惩罚Cox回归中，预后良好组相比预后不良组RFS显著改善（HR 0.104，95% CI 0.001–0.854，p = 0.0316），中等组无显著差异（HR 0.654，p = 0.3497），pT3–pT4a类别亦无统计学显著性（HR 2.280，p = 0.0972）。
讨论部分总结：研究人员指出，TSCC中可靠复发预测因素的识别因研究间终点定义不一致、浸润深度（DOI）和手术切缘阈值可变以及回顾性队列中辅助治疗的混杂效应而复杂化。R分类虽为公认的复发预后因素，但反映的是手术质量而非肿瘤侵袭性。因此，本研究聚焦于可从肿瘤标本本身提取的反映内在肿瘤生物学的特征。研究人员通过计算机辅助图像分析客观提取肿瘤和间质相关特征（TSR、LSCR、MPP评分），同时评估Trop-2作为候选免疫组织化学标志物。研究建立在Brandwein-Gensler等提出的风险评分系统基础上，但MPP评分评估整个数字化TSCC标本，可检测可能被忽视的小肿瘤岛。与既往研究将高TSR与较差生存关联不同，本研究中较高TSR反而倾向于改善RFS（虽未达统计学显著性），可能部分归因于方法学差异——研究人员量化整个肿瘤区室的间质而非仅肿瘤外周间质丰富区域。LSCR较高值与改善RFS的趋势相关（p = 0.052），值得进一步研究。与Erber等报道的Trop-2预后效应不同，本研究未重现Trop-2表达的显著不良预后效应，方法学差异（不同一抗、数据衍生H-score截断值而非中位数）可能部分解释这些发现。交叉验证表明加入Trop-2未改善区分度，因此不支持将Trop-2纳入最终三标志物复合评分。复合评分相比传统分级产生三个有序预后组，预后良好组5年RFS为100%，而预后不良组复发可发生在5年之后，提示预后不良组患者可能需要个性化延长监测策略。研究局限性包括回顾性单中心设计、复发事件数量有限、预后良好组样本量较小、标志物截断值和复合评分分组均在本队列RFS中衍生、置换分析条件于已衍生分组分配因而未考虑基于结局的截断值选择、交叉验证区分度低于表观分析提示初始估计存在乐观偏倚。预后阈值和复合评分需在更大独立队列中外部验证后方可临床实施。队列刻意限制为活动舌鳞状细胞癌，其生物学行为与其他口腔亚部位不同，预后阈值和复合权重是否可转移至其他亚部位尚待确定。
研究结论翻译：总之，研究人员开发了一种数字化衍生的复合评分，整合了肿瘤生长模式、间质含量和间质细胞组成的定量测量。在重复交叉验证中，其区分度与传统预后因素无法区分。预后良好组较低的复发风险为探索性估计，因其未经交叉验证且来源于无复发事件的小样本组。通过捕捉整个WSI的信息，该复合评分可能在复发风险评估中补充常规组织学特征。该评分、其阈值及风险估计在临床实施前需外部验证。
