《Journal of Infection》：The evolution of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in Greek intensive care units is driven by local carbapenemase acquisition, nationwide nosocomial spread and emerging resistance to novel antimicrobials
编辑推荐：
目的：研究人员调查了希腊ICU中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CR-Kp）的传播模式及治疗选择。方法：2021—2023年间从17个希腊ICU的患者中前瞻性收集CR-Kp分离株（N=271）（INCREASE研究，由Pfizer资助）。采用肉汤微量稀释法确定药敏谱
目的：研究人员调查了希腊ICU中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CR-Kp）的传播模式及治疗选择。方法：2021—2023年间从17个希腊ICU的患者中前瞻性收集CR-Kp分离株（N=271）（INCREASE研究，由Pfizer资助）。采用肉汤微量稀释法确定药敏谱，并使用Oxford Nanopore进行基因组测序。结果：所有分离株均产碳青霉烯酶：48%为KPC，20%为NDM，4.4%为VIM，27.6%为多碳青霉烯酶产生菌。对碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和复方磺胺甲噁唑的耐药率均超过90%，但阿米卡星（73.4%）和黏菌素（46.5%）除外。氨曲南-阿维巴坦和头孢吡肟-齐地巴坦的敏感性最高，分别为94.5%和91.6%，但在多碳青霉烯酶产生菌中耐药率>10%。检测到对头孢地尔（41.7%）和头孢吡肟-坦尼硼巴坦（21.4%）的高水平耐药。氨曲南-阿维巴坦耐药与VEB-25及一种新型VEB变异体共现。主要序列型包括ST39（28.1%）、ST11（22.7%）和ST258（18.4%）。时间标定系统发育分析表明，在克隆群（CG）输入后，CR-Kp常获得多种碳青霉烯酶。超过88%的分离株涉及跨越全国1—8个ICU的传播簇。结论：在希腊ICU中，CR-Kp似乎通过本地质粒获得而出现，随后在医院内和医院间传播。尽管氨曲南-阿维巴坦和头孢吡肟-齐地巴坦仍是有前景的治疗选择，但多碳青霉烯酶产生菌中的耐药及诊断缺口（尤其是VEB变异体）令人担忧。
研究背景方面，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CR-Kp）是新兴的医疗保健相关威胁，与超额发病率和死亡率相关，治疗选择有限。在欧盟/欧洲经济区（EU/EEA），CR-Kp感染的患病率和发病率在过去十年中显著上升。世界卫生组织（WHO）2024年细菌优先病原体清单继续将CR-Kp列为最高优先级（"关键"）病原体。希腊是全球抗菌药物耐药（AMR）负担最高的国家之一，主要由CR-Kp驱动。2015年EU/EEA国家的经济分析确定希腊是碳青霉烯耐药革兰阴性菌感染所致伤残调整生命年（DALYs）最高的国家，CR-Kp是主要贡献者。欧洲疾病预防控制中心（ECDC）最近报告显示，希腊医院提交的肺炎克雷伯菌分离株中72%对碳青霉烯类耐药。2024年4月ECDC国家访问将情况描述为"高度令人担忧"，并敦促该国"宣布AMR为最高国家优先级的公共卫生状况"。希腊CR-Kp感染高流行的原因尚未完全了解；多种因素可能 contribut，包括通过旅行和旅游业从其他国家引入成功克隆、持续的院内和院间传播以及高抗生素消费（2023年EU总消费量最高），但这些驱动因素的相对重要性仍未完全明确。为理解CR-Kp的进化和传播，并评估其对新型治疗选择的敏感性，研究人员对希腊ICU中的CR-Kp进行了详细的分子流行病学分析。
研究人员开展了前瞻性、非干预性、全国性ICU队列研究（INCREASE研究），纳入2021年5月至2023年12月期间希腊17个成人ICU中连续收治的≥18岁、入住ICU≥48小时、微生物学确诊碳青霉烯耐药肠杆菌目（CRE）感染的患者。17个成人ICU占希腊公共卫生保健系统成人ICU的29.3%（17/58）。研究期间271例符合条件的CR-Kp感染患者纳入分析。主要结论为：在希腊ICU中，CR-Kp似乎通过本地质粒获得而出现，随后在医院内和医院间传播；氨曲南-阿维巴坦和头孢吡肟-齐地巴坦仍是有前景的治疗选择，但多碳青霉烯酶产生菌中的耐药及诊断缺口令人担忧。重要意义在于揭示了CR-Kp在希腊ICU中的进化驱动因素，强调了质粒传播研究和加强感染预防与控制（IPC）干预的必要性，并对国际治疗指南和抗菌药物研发管线优先级具有启示意义。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用肉汤微量稀释法（BMD）进行标准抗菌药物及八种新型抗菌药物的药敏试验（AST），采用UMIC?头孢地尔进行头孢地尔药敏试验，依据EUCAST 2025 v15.0折点判读；采用Oxford Nanopore PromethION 2 Solo平台（R10.4 flowcells）进行全基因组测序（WGS），Flye v2.9.5组装、Medaka v2.0.1抛光；RGI v4.0.3结合CARD数据库检测AMR基因，Kleborate v3.1.3检测毒力位点及OmpK35/OmpK36突变；采用Institut Pasteur cgMLSTv2 629位点方案进行分型；Panaroo推断泛基因组，Gubbins检测并屏蔽重组，IQ-TREE 3构建最大似然系统发育树，BactDating v1.1.4进行分子钟定年；通过cgMLST等位基因差异和核心基因组SNP距离推断传播簇。样本队列来源为希腊17个成人ICU的前瞻性队列（INCREASE研究）。
研究结果方面：一般队列特征——共收集来自17个不同ICU的271株肺炎克雷伯菌分离株，其中256株（94.5%）成功测序。271株分离株占研究期间参与ICU中所有符合条件的CR-Kp感染患者的48%（271/564）。大多数分离株来自血液（69%）、支气管肺泡灌洗液（11.1%）、痰液（9.3%）。测序分离株中未发现高毒力菌株。碳青霉烯酶——所有分离株均产碳青霉烯酶，48%为KPC，20%为NDM，4.4%为VIM，27.6%为多碳青霉烯酶产生菌，包括KPC与金属β-内酰胺酶（MBL）组合，另有两株为NDM与OXA-48产生菌。检测到五种已知导致头孢他啶-阿维巴坦耐药的KPC变异体（KPC-21、KPC-31、KPC-33、KPC-44、KPC-121），分布于7株分离株中，另有2株携带两种新型KPC变异体。所有NDM产生株均产NDM-1，除一株VIM-75外所有VIM产生株均产VIM-1。16.8%的分离株检测到VEB变异体，包括VEB-1（13.3%）、VEB-25（2.7%）和一种新型VEB-35样变异体（0.8%）。抗菌药物敏感性试验结果——所有分离株均对碳青霉烯类耐药，对亚胺培南耐药率99.3%，对美罗培南耐药率91.9%。对黏菌素的敏感性仅为53.5%。四环素类药物保留一定体外活性，依拉环素和替加环素在0.5 mg/L时敏感性分别为60.5%和53.9%，在1 mg/L时分别为89.7%和81.6%。在新型抗菌药物中，氨曲南-阿维巴坦和头孢吡肟-齐地巴坦在整个队列中体外活性最高，分别为94.5%和91.6%。氨曲南-阿维巴坦对NDM产生株尤其活跃（98.1%），头孢吡肟-齐地巴坦对KPC产生株活跃（99.2%）。两种抗菌药物在多碳青霉烯酶产生菌中的敏感性均低于90%。头孢地尔耐药水平高（全队列41.7%），尤其在NDM产生株中（77.8%）。头孢吡肟-坦尼硼巴坦对21.4%的所有分离株MIC高于8/4 mg/L，在多碳青霉烯酶产生菌中尤其高（58.7%高于临时折点）。美罗培南-伐硼巴坦和亚胺培南-瑞来巴坦对KPC产生株显示高活性（均为97.7%），头孢他啶-阿维巴坦略低，敏感性为91.5%。新型β-内酰胺酶及其他特殊表型的鉴定——检测到的新型VEB变异体在KTG基序（第234—236位）第235位发生苏氨酸至异亮氨酸替换，紧邻先前描述的导致VEB-25变异的第234位赖氨酸至精氨酸突变，两种变异体均为VEB-1的单步突变。所有产VEB-25和新型VEB变异体的CR-Kp对氨曲南-阿维巴坦（≥8 mg/L）及头孢他啶-阿维巴坦（≥32 mg/L）MIC均升高，而产VEB-1分离株对两种抗菌药物的MIC均较低。鉴定出两种新型KPC变异体，均源自KPC-2，与KPC-163最密切相关，均在270环Ambler第269位携带插入；变异体1还在Ω环具有D169Y替换。表型上，变异体1对头孢他啶-阿维巴坦显示高水平耐药（MIC>32 mg/L），但对美罗培南-伐硼巴坦（MIC 1 mg/L）和亚胺培南-瑞来巴坦（MIC 0.5 mg/L）仍敏感；第二种变异体的表型判读因共同产生VIM酶而受阻。64.5%的分离株检测到OmpK35和/或OmpK36突变。在多个青霉素结合蛋白（PBP）中鉴定到SNP，但未对应任何特殊表型；PBP中未观察到插入或截短。相反，cirA和fiu的截短分别见于2株和13株分离株，均与头孢地尔MIC升高相关（均≥8 mg/L），而fepC截短无此关联。碳青霉烯酶拷贝数与任何新型药物的MIC均无关。AcrAB–TolC外排泵预测在所有分离株中激活。尽管对黏菌素和四环素类高水平耐药，但未检测到mcr或tet(X)基因。cgMLST分型——最常见的序列型为ST39（28.1%）、ST11（22.7%）和ST258（18.4%）；最常见的克隆群为CG39（28.9%）和CG258（27.7%）。所有研究分离株均可采用cgMLSTv2 629位点方案分型（中位缺失等位基因5；IQR 4–6；范围1–24），全球集合中41,257株（97.1%）分离株亦可分型。研究分离株主要定位于涵盖六个CG的七个树区域，包括CG258内两个不同区域。同一或相邻圆圈中的频繁共定位提示完美或近乎完美的等位基因匹配（如CG323内）。KPC、NDM和OXA-48在明确描述的高风险克隆中常见，但也广泛分散于多个分支，与频繁水平基因转移而非单一克隆扩增一致。包括本研究分离株在内，仅鉴定到87株产VEB肺炎克雷伯菌，主要为VEB-1产生株。所有VEB-25产生株均属于CG323，且仅在希腊样本中检测到。值得注意的是，检测到的两种新型VEB变异体发生于同时携带VEB-1的CG258和CG340分离株中，提示至少在一个CG中发生新发突变。希腊ICU克隆群的起源和传播——对研究的四个CG（CG39、CG323、CG3666、CG147）检测到时间信号。CG39可能于1999年左右在西班牙作为产VIM克隆出现，随后传播至非洲、亚洲和美洲，在多个谱系中VIM决定簇丢失；约2007年进入希腊，在该克隆中首次注意到产KPC能力并成为优势，随后向其他欧洲国家（即德国）传播。CG323的完整时间标定重建不可能，可能反映未采样祖先，最近共同祖先（MRCA） dating 约1987年；该克隆似乎于2001年到达希腊，再次成为优势KPC产生菌；包括VEB-25在内的VEB酶的本地获得仅限于希腊分离株。CG3666的起源亦不明确，最早两株分离株于2005年在英国检测到，但MRCA可能 dating 约1996年，提示未采样祖先群体；该谱系迅速传播至多个国家并成为NDM产生菌，可能约2007年以此进入希腊。CG147的起源亦不明确，最早分离株约2005年在希腊检测到，但MRCA projected 至1977年，排除了与希腊出现的明确联系；再次观察到向希腊境外的传播；希腊菌株中KPC和VIM获得常见，支持CG147作为高风险克隆的分类。希腊ICU中CR-Kp的院内和院间传播——使用cgMLST等位基因差异，检测到9个传播簇，包括98.4%（252/256）的分离株。大多数成对比较远低于10个等位基因阈值（许多≤4个等位基因），与密切遗传相关性一致，许多分离株共享相同cgMLST谱。成对SNP距离在52-SNP cutoff下跨CG恢复相同的9个簇；相比之下，21-SNP阈值导致88.7%（227/256）的分离株被聚类，大多数（168/227，73.6%）位于原始9个簇内，其余形成21个额外较小簇。簇大小不一，涉及1—8个ICU。所有ICU均贡献于传播网络，包括分离株<5株的ICU。几个簇跨越多个ICU，具有几乎遗传不可区分（0个等位基因差异，≤10个SNP差异）的分离株（如簇1、2、4、9），而其他显示近identical基因组的ICU内暴发（如簇7中ICU14或ICU10；簇3中ICU6）。许多簇涉及不同城市的医院。在两年采样期内跨多个城市ICU观察到的高遗传相似性引起对希腊ICU中CR-Kp持续院间和院内传播的担忧。
讨论部分总结：研究人员对希腊ICU中侵袭性CR-Kp进行了深入的分子和表型表征，并将这些数据置于全球肺炎克雷伯菌系统发育背景中。时间标定系统发育和传播分析表明，尽管国际肺炎克雷伯菌克隆群频繁输入希腊，但碳青霉烯酶产生很可能在希腊境内从循环MGE获得；广泛耐药（XDR）CR-Kp随后在ICU内和ICU间传播，可能由抗菌药物压力、院间转运、IPC基础设施缺口和收治医院常规轮转促成。INCREASE研究在希腊COVID-19期间进行，ICU床位压力和机构间转运常见，进一步放大了传播风险。这些发现强化了先前的观察，即CR-Kp是高度成功的医疗保健相关病原体，能够在医院内和医院间高效传播。数据表明AMR可能通过希腊境内多碳青霉烯酶携带质粒的获得及随后的传播而放大；这种模式在本数据集中两个CG中独立观察到，驱动地方性流行，可能适用于其他高负担AMR环境。采用SNP方法的传播簇分离株比例（88.7%）高于其他高负担AMR环境（如意大利65.4%），提示希腊CR-Kp负担可能更高。此外，尽管高负担克隆经典上与特定碳青霉烯酶相关（如CG258–KPC），但观察到CG与碳青霉烯酶类型的频繁解耦，多个成功CG在不同地区携带不同碳青霉烯酶（如CG39在希腊为KPC产生菌，在南非为OXA-48样产生菌）。总体而言，结果主张更重视质粒传播研究，包括稳健的质粒分型和追踪，同时加强IPC干预以遏制成功克隆和MGE在希腊等地方性流行环境的传播，符合最近的ECDC建议。关于新型治疗选择和耐药决定因素的发现对国际治疗指南和抗菌药物管线优先级具有启示意义。氨曲南-阿维巴坦和头孢吡肟-齐地巴坦对该具有挑战性的集合显示出强效活性，与先前报告一致；尽管这些新型药物尚未广泛临床使用，但多碳青霉烯酶产生菌使两种药物的耐药率在本队列中达到>10%，高于先前监测研究报告的比例，值得持续监测。总体而言，41.7%的分离株对头孢地尔耐药，该药物在研究期间未在希腊上市；这种意外高的基线耐药表明在该环境中不能假定头孢地尔活性，支持临床使用前进行药敏试验，尤其是对NDM产生菌。在KPC产生菌中，头孢他啶-阿维巴坦、美罗培南-伐硼巴坦和亚胺培南-瑞来巴坦保留高体外活性，与意大利和英国最近的监测研究广泛一致；然而，队列中KPC变异体的频率仍令人担忧，尤其是对头孢他啶-阿维巴坦，此类变异体与该药物耐药日益相关。重要的是，这些发现不应被解释为支持无限制使用新型抗菌药物，因为AMM对于保持其活性及现有治疗选择的活性仍然至关重要。还观察到VEB-25（及另一种新型VEB变异体）与氨曲南-阿维巴坦耐药的关联；该机制不同于VIM和NDM等MBL介导的耐药（通过锌依赖性水解赋予耐药）。类似的关联已有报道 for 头孢他啶-阿维巴坦，提示某些VEB变异体被阿维巴坦抑制不佳；需要对发现进行实验验证。在本数据集中，CR-Kp中的VEB变异体集中在希腊，引起对区域出现及国际传播风险的担忧，如希腊境外近期有该国医疗保健暴露的患者中检测到VEB-25的报告。监测受阻是因为VEB未纳入大多数常用快速碳青霉烯酶PCR panel（聚焦于五大碳青霉烯酶），强调需要扩展诊断和AST。鉴于VEB变异体与本集合中某些最后线BL/BLI组合活性降低的关联，需要仔细监测和遏制，同时扩大碳青霉烯耐药感染的诊断能力。队列中多碳青霉烯酶产生CR-Kp的患病率（27.6%）显著高于西班牙（3%）、意大利（1%）、阿根廷（8%）和英国（4%）的国家队列报告，尽管ICU特异性数据仍有限。这一发现具有临床和流行病学重要性。临床上，多碳青霉烯酶产生菌可能同时损害几种新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的活性，可能积累β-内酰胺以外的耐药决定因素，并可使表型碳青霉烯酶检测复杂化。流行病学上，其出现提示先前不同的耐药机制的趋同，通常由多个MGE的水平转移介导。由于质粒携带可能对细菌宿主施加适应度成本，携带多个碳青霉烯酶决定因素的菌株尽管有此负担仍持续和扩增，可能表明 substantial 抗菌药物选择压力和相当大的暴发潜力。因此，有必要在国家监测规划中持续监测多碳青霉烯酶产生CR-Kp。研究优势包括：分析了高AMR负担环境中近期、多中心、前瞻性收集的CR-Kp队列，该环境中断传播是声明的公共卫生优先事项；发现可能对其他高负担地区（南欧、亚洲部分地区和美洲）具有参考价值；结合了参考级实验室AST与高分辨率基因组流行病学，并利用了最新的Oxford Nanopore R10.4化学测序技术，非常适合解析质粒和定位AMR基因。局限性包括：样本中某些ICU占主导可能影响代表性，但所有ICU均出现在传播簇中，提示主要循环菌株已被捕获；传播的流行病学元数据不可用；无法解析所有特殊表型，部分因为RNA表达研究超出范围，因此外排或碳青霉烯酶表达水平等机制仍是合理解释；未进行实验验证以证明VEB变异体直接导致观察到的氨曲南-阿维巴坦MIC升高，因此结果应解释为关联；尽管全球菌株集合广泛且采样广泛，仍可能遗漏本研究鉴定的希腊境外预先存在的产KPC CG39和CG323 CR-Kp菌株，但在两个独立CG中观察到相同模式使这种可能性降低；未直接分析质粒结构或传播，尽管基因组模式与耐药决定因素的水平获得一致，但需要专门的质粒分析来确定单个质粒对传播的贡献，此类分析是未来工作的重要优先事项。
研究结论翻译：总体而言，研究人员的发现表明，希腊ICU中的CR-Kp感染很可能由碳青霉烯酶的本地获得驱动，随后在医院内和医院间传播。这些动态，由机构间患者流动和IPC缺口放大，强调需要在希腊等地方性流行环境进行协调的、系统级的CR-Kp控制。尽管对该国尚未广泛临床使用的许多药物发现高水平耐药，但氨曲南-阿维巴坦和头孢吡肟-齐地巴坦对多样碳青霉烯酶背景保留了 substantial 活性。然而，这些新型抗菌药物对队列中常见的多碳青霉烯酶产生菌显示出降低的疗效。这凸显了积极监测多碳青霉烯酶产生微生物并结合抗菌药物管理和改进IPC努力以控制这些微生物（尤其是VEB变异体）传播的重要性。以病原体和患者为中心的监测应继续成为这些努力的核心，而在可行时纳入质粒水平分析可能为耐药决定因素的水平传播提供补充洞察，特别是在流行病学研究、暴发调查和靶向监测中。这些行动，连同对新型BL/BLI组合的持续评估，应超越希腊为临床指导和公共卫生策略提供信息。
