基于膜饲与毛细管饲喂联用视频验证的肩突硬蜱（Ixodes scapularis）成年雌蜱吸血行为取食电位图（EPG）波形特征与吸血生理机制研究

《Journal of Insect Physiology》：An integrated approach toward understanding mechanisms of blood-feeding in adult females of the blacklegged tick, Ixodes scapularis

　　

吸血对蜱的生存与繁殖至关重要，并在蜱—宿主互作及病原体传播中发挥关键作用。开发新型蜱类防控技术（如具有新作用机制、可阻断蜱吸血过程的新型杀螨剂）需要更深入理解蜱吸血的生物学过程与生理机制。取食"电位图"最早由Gregson（1969）用于研究安氏革蜱（Dermacentor andersoni）饱血雌蜱的吸血，不同电波形可被识别为吸血的"吸血"阶段或"唾液分泌"阶段；该技术随后用于其他蜱种，包括龟形花蜱（Hyalomma aegyptium）与微小牛蜱（Boophilus microplus）。此后关于蜱取食"电位图"的研究报道较少，而该技术已成功应用于吻蝽（Rhodnius prolixus、Triatoma infestans）及臭虫（Cimex lectularius、C. hemipterus）吸血行为与生理研究。取食电位图（EPG）作为取食电位图技术的现代版本，在刺吸式植食性昆虫（粉虱、蚜虫、叶蝉）取食行为/生理研究中取得巨大成功，并得益于第三代AC-DC EPG技术的发展；近年来EPG应用已扩展至蚊虫吸血行为研究。将EPG重新用于蜱吸血研究，已实现对变异革蜱（Dermacentor variabilis）与美洲钝眼蜱（Amblyomma americanum）成虫吸血相关特异性EPG波形的表征。然而，仍需进一步研究以阐明蜱吸血的生理机制及杀螨剂作用。早期关于肩突硬蜱（Ixodes scapularis）传播病原体（包括莱姆病病原体伯氏疏螺旋体Borrelia burgdorferi）的实验室研究借助毛细管饲喂技术开展；在借鉴欧洲研究者为蓖麻硬蜱（Ixodes ricinus）开发硅胶膜人工饲喂技术的基础上，美国研究者亦开发并优化了针对肩突硬蜱的硅胶膜人工饲喂系统，以助力病原体获得与传播机制研究。该硅胶膜饲喂系统可使附着若蜱与雌蜱连续多日饲喂至饱血，为将人工膜饲喂系统与EPG记录技术结合、考察蜱吸血活动动态提供了独特契机。研究人员建立了一种将EPG记录与蜱膜饲喂系统相结合的综合方法，以研究肩突硬蜱成年雌蜱持续吸血活动及其相关EPG波形。本研究目标为揭示附着于硅胶膜上的肩突硬蜱雌蜱整个吸血期相关的特征性EPG波形，并将其与以往报道的以活体动物（牛）为宿主的其他蜱种吸血EPG波形及上述早期蜱吸血"电位图"研究进行比较。研究人员通过将同步EPG记录与经毛细管饲喂牛血的雌蜱摄像观察相结合的附加实验，实现了该研究目标。

研究背景与问题：肩突硬蜱（Ixodes scapularis）是北美多种重要人畜病原体的传播媒介，可传播无浆体病、巴贝虫病、埃立克体病、硬蜱回归热、莱姆病及波瓦桑病毒；莱姆病是美国最重要的媒介传播疾病，2022年确诊病例逾89,000例、估计感染人数超过470,000人，而东北部与中西部上游地区的莱姆病病原体伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）仅由该蜱传播。吸血是蜱生存与繁殖的必要条件，也是蜱—宿主互作与病原体传播的关键环节；开发具有新作用机制、可阻断吸血过程的新型杀螨剂，需要更深入理解蜱吸血的生物学过程与生理机制。取食电位图（electropenetrography，EPG）是取食电位图技术的现代版本，在刺吸式植食性昆虫研究中取得成功，并已扩展至蚊虫吸血研究；将EPG重新用于蜱类研究，已表征变异革蜱（Dermacentor variabilis）与美洲钝眼蜱（Amblyomma americanum）成虫吸血相关波形，但仍需进一步研究以阐明蜱吸血生理机制与杀螨剂作用。硅胶膜人工饲喂系统可使肩突硬蜱若蜱与雌蜱连续多日饲喂至饱血，为将膜饲喂系统与EPG记录结合、考察持续吸血活动提供了独特契机。因此，研究人员建立将EPG记录与蜱膜饲喂系统相结合的综合方法，旨在揭示附着于硅胶膜的肩突硬蜱雌蜱整个吸血期的特征性EPG波形，并与以活体牛为宿主的其他蜱种波形及早期"电位图"研究比较，同时通过同步EPG与摄像观察毛细管饲喂雌蜱加以验证。

主要技术方法：研究使用俄克拉何马州立大学蜱饲养设施提供的无病原体肩突硬蜱成虫，膜饲实验采用7月龄雌蜱；以Ecoflex? 00-30双组分硅胶制备厚度33–95 μm的硅胶膜，构建体外膜饲喂装置，以添加抗生素-抗真菌剂及1 mM ATP（三磷酸腺苷，phagostimulant，促食剂）的去纤维蛋白牛血于36–42 °C饲喂，每单元放入10只雌蜱与5只雄蜱以促进附着，并辅以牛毛与蜱粪粒提供嗅觉、触觉与化学刺激；采用毛细管饲喂系统以1:1牛血:血清混合物饲喂雌蜱并记录每日摄取量。EPG记录使用AC-DC四通道取食电位图仪（记录电极以导电银漆粘附于蜱背，参考电极置于血池或毛细管内），信号经降噪与数字化后用WinDaq软件记录；毛细管饲喂同步以数字显微摄像（30 fps，最长90 s）与LabChart 8软件记录，实现EPG与视频同步。波形按Reif and Backus（2021）层级系统命名并在"事件"水平分析，统计采用R软件（Version 4.5.1）中线性混合效应模型（linear mixed-effects models），以附着后天数为固定效应、蜱与天数为嵌套随机效应。

研究结果：（1）膜饲蜱长期取食行为——15次独立试验共引入53只成年雌蜱，仅6只成功附着并不同程度取食，无一完全饱血，附着持续0–9天，其中4只获得可用于波形分析的高质量EPG记录，共10个记录日。（2）附着后天数间的一般波形事件特征——鉴定出5类主要波形：Is1b为低频正弦样重复尖峰（4.11 ± 0.07 Hz），解释为吸血；Is1c为短促高频爆发（6.01 ± 0.11 Hz）并伴基线偏移，行为学意义未明；Is2c1为电压骤升后持续低电活动的平台（0.65 ± 0.17 Hz），解释为大量唾液分泌；Is2c2紧随Is2c1出现、为高频尖峰相（7.12 ± 0.28 Hz），解释为少量唾液分泌；IsR1为近乎平坦的静息（0.17 ± 0.02 Hz），IsR2为不规则低幅尖峰间断的静息（0.80 ± 0.09 Hz）且几乎仅出现于Is2c2之后；吸血相关波形振幅约0.47 nV（平台范围0.41–0.53 nV），吸血、唾液分泌与静息的周期性模式贯穿整个记录。（3）膜饲事件的描述性统计——Is1b出现最频繁，平均时长3.91 ± 0.23 s；Is1c平均1.30 ± 0.05 s；Is2c1平均3.46 ± 0.32 s；Is2c2平均1.96 ± 0.47 s；IsR1平均6.02 ± 0.32 s；IsR2最长，平均32.11 ± 3.20 s。（4）吸血尖峰频率随附着后天数增加（Is1b）——第1天最低（2.48 ± 0.07 Hz），第8、9天最高（5.67 ± 0.10 Hz与5.53 ± 0.15 Hz），线性混合效应模型证实尖峰频率随天数显著增加（β = 0.319 Hz/天，p = 0.005；4只蜱302个事件），而时长无显著变化（p = 0.49）。（5）静息波形事件的时间变化（IsR1与IsR2）——IsR1尖峰频率随天数小幅但显著升高（β = 0.033 Hz/天，p = 0.014），时长无显著变化；IsR2尖峰频率显著升高（β = 0.081 Hz/天，p = 0.031）、时长显著缩短（β = ?3.304 s/天，p = 0.047；3只蜱62个事件），即随取食推进IsR2变短且间断更频繁。（6）唾液分泌事件无时间变化（Is1c、Is2c1与Is2c2）——各波形尖峰频率与时长随天数均无显著变化。（7）膜饲蜱特有的未知波形事件——若干反复出现的波形无法归入已确立波形，其生理行为尚未确定。（8）毛细管饲喂蜱的取食行为验证——7只雌蜱全部饲喂成功，4只获得高质量同步EPG与摄像记录，饲喂持续6–8天（平均7天），总摄食量8.219–14.0425 μL（平均12.269 μL）。（9）经毛细管体积变化与摄像直接验证吸血与唾液分泌——Is1b尖峰与毛细管内血面下降呈1:1对应，据此估算每个吸血尖峰（推测为一次咽泵动作）摄食1.528 nL稀释血液；Is2c1与毛细管内液面上升呈1:1对应，并观察到透明液体自口下板释放形成气泡、使血液局部褪色；Is2c2对应液面轻微上升的低水平唾液分泌，支持将原统一Is2c细分为Is2c1（大量唾液分泌）与Is2c2（少量唾液分泌）。

讨论与结论：本研究首次对膜附着与毛细管饲喂的肩突硬蜱成年雌蜱进行电生理表征，鉴定出四类主要波形（Is1b、Is1c、IsR1、IsR2），并提出将既往定义的Is2c细分为两个生物学上不同的子事件；通过EPG与毛细管摄像配对，确认了主要吸血与唾液分泌信号的行为学意义；在所观察的全部波形中，仅吸血（Is1b）尖峰频率随附着后天数显著增加，提示长时间附着过程中取食生理发生时间性变化，而吸血尖峰频率增加在此前EPG研究中未见报道。所鉴定波形与美洲钝眼蜱、变异革蜱的既往描述高度相似，提示吸血、唾液分泌与非取食静息等取食过程主要组分在硬蜱科中保守，与宿主种类、取食基质或生活史差异无关。吸血尖峰频率升高的趋势可能反映咽泵输出或效率随取食进展而提高，与硬蜱由慢速取食相向快速取食相转变的经典描述一致；机制可能包括口器在膜内锚定改善、唾液腺分泌的渐进性调节增强液体摄取，或取食灶改变致流动阻力下降；虽不能排除蜱体膨胀改变膜—蜱界面电学性质的可能，但波形形态跨天的一致性不支持纯人为假象解释。静息波形IsR1与IsR2亦随天数显著变化，IsR2几乎仅出现于Is2c2之后，可能代表唾液分泌后的恢复期；其细微电活动可能反映低水平肌肉活动，如唾液腺调节、肠道蠕动、富离子唾液间歇排出或螯肢微调，提示静息状态本身可能是整个取食周期的组成部分而非简单停顿。毛细管饲喂与摄像配对对验证波形生物学含义至关重要，但毛细管饲喂为非自然取食方式，机械约束可能改变唾液分泌动态，其事件频率或振幅可能与自然取食不同。膜饲蜱中无法归类的波形可能反映膜特异性机械互作、短暂唾液调节或与黏附物维持、螯肢细微运动相关的未表征行为，因其在多个个体中反复出现而不太可能是假象，值得进一步研究。该综合方法亦可用于研究新型杀螨化合物作用方式并助力抗蜱疫苗开发；未来可结合肌电图（electromyography，EMG）记录、评估若蜱取食行为（若蜱是人类疾病的主要传播媒介且超出流行高峰后仍具感染性），并探讨蜱在病原血与非病原血上取食行为是否不同、携带病原体是否改变取食行为。结论部分译为：总之，本研究首次为肩突硬蜱成年雌蜱建立了经行为学验证的EPG波形类型，整合膜饲喂、毛细管饲喂与同步摄像，将特定电信号与离散取食行为相联系；确认波形Is1b对应吸血、Is2c1对应大量唾液分泌、Is2c2对应少量唾液分泌，从而为将先前统一的Is2c波形细分提供了依据；在所有波形类型中，仅吸血尖峰频率随取食时长显著增加，揭示了长时间附着过程中此前蜱类EPG研究未曾报道的动态生理转变；这一将长期膜饲喂与短期毛细管验证相结合的综合方法，为未来蜱取食生理、病原体传播动态以及靶向特定取食行为的杀螨剂或抗蜱疫苗筛选研究提供了稳健平台。