猪源枯草芽孢杆菌YB-X-721缓解沙门菌感染并改善仔猪肠道健康

《Journal of Functional Foods》：Porcine-derived Bacillus subtilis YB-X-721 alleviates Salmonella infection and improves piglets' intestinal health

　　

从健康成年猪粪便中分离出一株新型猪源枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YB-X-721，该菌株具有强耐酸/耐胆盐能力及对肠道致病菌的广谱抗菌活性。YB-X-721通过修复肠道屏障、减轻炎症与氧化应激，缓解鼠伤寒沙门菌（S. Typhimurium）诱导的小鼠结肠损伤。该菌株重塑肠道菌群结构并调控小鼠氨基酸与胆汁酸代谢通路。日粮添加YB-X-721可降低断奶仔猪腹泻率、改善生长性能并优化肠道菌群。

研究背景：沙门菌（Salmonella）是一种广泛存在的食源性肠道病原菌，主要影响幼龄动物和易感人群，感染可导致肠道炎症、腹泻，严重时可进展为败血症甚至死亡，不仅威胁动物健康，也危害公共卫生安全及畜牧业的稳定发展。猪对多种沙门菌血清型易感，感染可导致败血症和胃肠炎，增加死亡率、损害生长性能、提高治疗成本，给养猪业造成巨大经济损失。尽管抗生素仍是控制沙门菌感染的主要手段，但其过度使用导致耐药性增强、肠道菌群失调及免疫功能下降。因此，寻找天然安全的抗生素替代品并探究其生物学作用机制已成为当前研究热点。益生菌是一类无毒、无残留的活性微生物添加剂，通过促进消化酶分泌、增强肠道屏障功能、调节宿主免疫应答等机制改善肠道健康。芽孢杆菌（Bacillus）具有环境抵抗力强、分布广泛、肠道定植能力强等优势，其中枯草芽孢杆菌（B. subtilis）是畜牧生产中常用的促肠道健康益生菌。本研究旨在从健康成年猪粪便中分离筛选益生芽孢杆菌并研究其生物学特性，通过建立鼠伤寒沙门菌诱导肠炎的小鼠模型评价候选菌株对沙门菌诱导肠道炎症的治疗和预防效果，并以断奶仔猪为实验动物进一步验证其养猪生产中的应用潜力，为猪用益生菌开发及改善猪健康与抗逆性提供机制见解和转化支撑。

关键技术方法：研究人员从重庆饲养的20头健康、未使用抗生素的成年荣昌猪采集新鲜粪便样品，经80 °C水浴热处理、LB培养、梯度稀释涂布分离、革兰染色、芽孢染色及16S rDNA测序和系统发育树分析鉴定菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No. 28942）。通过测定600 nm光密度绘制生长曲线，并评估pH 2和3条件下的耐酸能力及0.2%、0.3%胆盐耐受能力。采用琼脂孔扩散法测定对大肠杆菌（E. coli O157:H7）、金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC6538）和鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium ATCC 14028）的抗菌活性。动物实验选用72只3周龄SPF级雄性ICR小鼠（18 ± 2 g），随机分为Control、S. Tm、YB-X-721和YB-X-721 + S. Tm四组，每组18只，试验期28 d；另选用54头28日龄荣昌仔猪（初始体重8.47 ± 0.24 kg），分为基础日粮对照组、商业益生菌阳性对照组（CPB，1 × 10⁷ CFU/g商业枯草芽孢杆菌）和YB-X-721组（1 × 10⁷ CFU/g），每组6个重复、每重复3头，试验期28 d。检测指标包括疾病活动指数（DAI）、生长性能与腹泻率、粪便微生物计数、结肠组织形态学（H&E染色）、过碘酸-雪夫（PAS）染色计数杯状细胞、血清和结肠抗氧化能力（CAT、T-SOD、T-AOC、MDA）、血清细胞因子（ELISA）、结肠免疫荧光（CD3、CD4、CD8）、盲肠内容物代谢组学（UPLC-Q-TOF/MS）及16S rRNA基因测序和PICRUSt2功能预测。

研究结果：
3.1 枯草芽孢杆菌YB-X-721的鉴定：菌落直径约2–4 mm，呈乳白色、不透明、表面光滑、微隆起；革兰染色阳性，芽孢染色阳性；16S rDNA测序经BLAST比对和系统发育树分析显示与枯草芽孢杆菌基因序列同源性达99%，故命名为B. subtilis YB-X-721。
3.2 枯草芽孢杆菌YB-X-721的体外益生特性与抗菌活性：该菌株2 h进入对数生长期、8 h进入稳定期；pH 2和3条件下2 h存活率分别为102.36%和102.66%，4 h存活率分别为75.24%和77.91%；含0.15%和0.3%胆盐培养基中2 h存活率分别为247.56%和228.35%，4 h存活率分别为78.22%和78.08%，表明其具有较强肠道定植和存活能力；抗菌试验显示该菌株可抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门菌ATCC14028的生长，其中对金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑制作用尤为显著。
3.3 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠体重和DAI评分的影响：S. Tm组和YB-X-721 + S. Tm组体重自第2天开始下降，S. Tm组下降较YB-X-721 + S. Tm组更明显；对照组和YB-X-721组体重第1至7天稳步增加；DAI评分显示S. Tm组和YB-X-721 + S. Tm组自第2天逐渐升高，YB-X-721 + S. Tm组DAI评分升高显著低于S. Tm组，表明YB-X-721可缓解鼠伤寒沙门菌感染引起的小鼠体重下降和腹泻症状。
3.4 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肠道形态的影响：感染小鼠结肠长度较对照组显著缩短（P < 0.05），YB-X-721 + S. Tm组结肠长度显著长于感染组（P < 0.05）；组织学分析显示感染小鼠结肠黏膜上皮脱落、黏膜厚度减少、固有层炎性细胞浸润，YB-X-721 + S. Tm组结肠黏膜大多完整、仅轻微上皮脱落；阿尔新蓝/PAS染色显示感染小鼠结肠杯状细胞数量显著减少，YB-X-721 + S. Tm组杯状细胞数量显著恢复（P < 0.05）。
3.5 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠抗氧化能力的影响：对照组与YB-X-721组各指标无显著差异（P > 0.05）；与对照组相比，S. Tm组血清和结肠MDA浓度显著升高，T-AOC水平及CAT、T-SOD活性显著降低（P < 0.05）；与S. Tm组相比，YB-X-721 + S. Tm组血清和结肠MDA水平显著降低，CAT活性和T-AOC水平显著增强（P < 0.05），表明YB-X-721对感染小鼠抗氧化活性具有积极作用。
3.6 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠血清细胞因子的影响：S. Tm组血清促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平显著高于对照组和YB-X-721组（P < 0.05）；与S. Tm组相比，YB-X-721 + S. Tm组IL-1β和IL-6水平显著降低（P < 0.05）；S. Tm组抗炎细胞因子IL-4和IL-10水平显著低于对照组（P < 0.05），YB-X-721 + S. Tm组IL-4水平较S. Tm组显著升高（P < 0.05）。
3.7 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠结肠CD3、CD4和CD8表达的影响：对照组和YB-X-721组CD3⁺和CD4⁺ T细胞分布较均匀且数量少，CD8⁺ T细胞相对富集；S. Tm组CD3⁺和CD4⁺ T细胞显著增加并呈灶性浸润聚集，CD8⁺ T细胞比例下降；与S. Tm组相比，YB-X-721 + S. Tm组结肠组织CD3⁺和CD4⁺ T细胞表达水平显著下调（P < 0.05），CD8⁺ T细胞表达水平显著上调（P < 0.05）。
3.8 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肠道菌群的影响：主坐标分析（PCoA）显示S. Tm组与其他组无显著分离；α多样性分析显示各组Shannon指数、ACE指数和Simpson指数无显著差异（P > 0.05）；门水平盲肠菌群主要由Bacillota、Bacteroidota、Verrucomicrobiota、Actinomycetota、Pseudomonadota、Deferribacterota和Patescibacteria组成；属水平相对丰度组间存在差异，Wilcoxon秩和检验显示组间肠道菌群组成存在显著差异；与对照组相比，S. Tm组Salmonella、Mucispirillum、Blautia、Phascolarctobacterium和Butyricimonas丰度增加，Lactobacillus、Adlercreutzia、Candidatus Saccharimonas和Candidatus Arthromitus丰度降低，其中Salmonella在S. Tm组显著富集（P = 0.00273，效应量 = 7.894），Lactobacillus在对照组更丰富（P = 0.03064，效应量 = 13.27）；与S. Tm组相比，YB + STm组Salmonella、Prevotellaceae NK3B31、Anacrofusiis和Anaerofustis丰度降低，Turicibacter、Roseburia、Gordonibacter、Faecalimonas、Coriobacterigceae_UCG-002和Family_Xll_UCG-001丰度增加，其中Salmonella丰度差异最显著（P = 0.00427，效应量 = 7.891），表明YB-X-721干预有效调节肠道菌群结构并显著降低潜在致病菌的肠道定植水平。
3.9 枯草芽孢杆菌YB-X-721对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肠道内容物代谢物谱的影响：PCA分析显示S. Tm组与Control、YB-X-721和YB-X-721 + S. Tm组显著分离（P = 0.001），表明口服鼠伤寒沙门菌显著改变小鼠盲肠内容物代谢组，而YB-X-721干预有效缓解感染引起的代谢变化；PLS-DA进一步证实上述发现；以VIP ≥ 1且P < 0.05筛选差异代谢物，Control组与S. Tm组间鉴定出1595种差异代谢物（1017种上调、578种下调），S. Tm组与YB-X-721 + S. Tm组间1208种代谢物水平显著变化（557种上调、651种下调）；对丰度前30的差异代谢物进行层次聚类并以热图展示。KEGG通路富集分析显示，Control组与S. Tm组差异代谢物显著富集于辅因子生物合成、胆汁分泌、黄酮类和苯丙素类生物合成与降解、初级和次级胆汁酸生物合成、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、组氨酸代谢及嘌呤核苷酸代谢等通路；S. Tm组与YB-X-721 + S. Tm组比较显示，YB-X-721干预主要影响黄酮类和黄烷醇类生物合成与降解、苯丙素类生物合成、神经活性配体-受体相互作用、初级胆汁酸生物合成、叶酸生物合成、β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成及精氨酸、脯氨酸和色氨酸代谢等通路。
3.10 微生物组与代谢组的相关性分析：研究人员对丰度前30的代谢物与门和属水平丰度前10的微生物类群进行Spearman相关分析。门水平上，Bacillota和Patescibacteria与cavipetin C、1β,3α,7β-三羟基-5β-胆烷酸和12α-羟基-3-氧代-5β-胆烷-24-酸呈正相关（P < 0.05）；Deferribacterota与6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸和cervonoyl乙醇酰胺呈负相关，与16-羟基十六烷酸呈正相关（P < 0.05）；Actinomycetota与6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸呈正相关（P < 0.01）。属水平上，Salmonella与6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、cervonoyl乙醇酰胺和猪去氧胆酸呈负相关（P < 0.001），亦与cavipetin C、1β,3α,7β-三羟基-5β-胆烷酸和12α-羟基-3-氧代-5β-胆烷-24-酸呈负相关（P < 0.05）；Duboseria与6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、猪去氧胆酸和1β,3α,7β-三羟基-5β-胆烷酸呈正相关（P < 0.05）；Lactobacillus和Adlercreutzia与猪去氧胆酸呈正相关（P < 0.05）；Ruminococcus与12α-羟基-3-氧代-5β-胆烷-24-酸和1β,3α,7β-三羟基-5β-胆烷酸呈正相关（P < 0.01）；Roseburia与12α-羟基-3-氧代-5β-胆烷-24-酸呈正相关（P < 0.01）。
3.11 枯草芽孢杆菌YB-X-721对断奶仔猪生长性能和抗氧化能力的影响：与对照组相比，YB-X-721组初始和终末体重无显著差异（P > 0.05），但平均日增重显著提高（P < 0.05），料重比和腹泻率显著降低（P < 0.05），表明日粮添加YB-X-721改善断奶仔猪生长性能；与对照组相比，YB-X-721组断奶仔猪粪便中Lactobacillus数量显著增加（P < 0.05），YB-X-721组和商业益生菌组粪便中E. coli和Salmonella数量均显著降低（P < 0.05）；与对照组相比，YB-X-721组血清GSH-Px活性显著增强（P < 0.05），MDA含量无显著差异（P > 0.05）。

讨论与结论：研究人员从健康未使用抗生素猪粪便样品中分离获得具有益生潜力的枯草芽孢杆菌YB-X-721，其具有良好的耐酸耐胆盐能力，可有效抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门菌ATCC14028等致病菌生长，展现出较强抗菌活性和肠道适应性，与既往研究结果一致。通过建立鼠伤寒沙门菌感染小鼠肠道炎症模型，经肠道氧化应激、炎症反应、代谢组学和微生物多样性分析系统评价YB-X-721对沙门菌感染诱导肠道损伤的保护作用，发现YB-X-721预处理可缓解体重下降、改善粪便性状和隐血状况、减轻结肠黏膜上皮脱落、炎性细胞浸润和杯状细胞减少，保护肠道完整性；增强肠道抗氧化能力，降低血清和肠道MDA水平，提高CAT、T-SOD活性和T-AOC水平；降低血清TNF-α和IL-1β水平、升高IL-4和IL-10水平，并抑制CD3⁺和CD4⁺ T细胞过度活化、恢复CD8⁺ T细胞应答；显著抑制Salmonella丰度增加并逆转感染导致的Roseburia和Turicibacter相对丰度降低；KEGG分析显示YB-X-721干预主要影响精氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸代谢及胆汁分泌、初级和次级胆汁酸代谢等通路；Spearman相关分析揭示肠道菌群与代谢物间的显著关联。在断奶仔猪生产中，日粮添加YB-X-721显著降低腹泻率、改善生长性能和抗氧化能力，有效抑制大肠杆菌和沙门菌等致病菌增殖并促进Lactobacillus定植。研究结论：研究人员从健康成年猪中分离出一株新型益生菌枯草芽孢杆菌YB-X-721，其具有强耐酸耐胆盐能力和抗菌活性；在小鼠中，YB-X-721通过增强抗氧化防御、减少氧化应激、调节免疫炎症反应（降低促炎细胞因子、增加抗炎细胞因子）减轻鼠伤寒沙门菌感染引起的结肠损伤；此外，YB-X-721通过促进Roseburia和Turicibacter等有益菌、抑制Salmonella等有害菌改善结肠菌群组成，并影响氨基酸和胆汁酸代谢；上述结果表明枯草芽孢杆菌YB-X-721具有作为缓解鼠伤寒沙门菌诱导结肠损伤益生菌的潜力，为其未来在养猪生产中的应用提供了基础。