《Journal of Functional Foods》：Multi-dimensional screening identifies
Lactiplantibacillus plantarum Hi188 and
Lacticaseibacillus paracasei Lc19 as probiotics with enhanced gastrointestinal tolerance, organoid adhesion, and barrier protection
编辑推荐：
通过胃肠道（GI）液体耐受性、胆盐抗性、类器官黏附和屏障保护对益生菌进行多维筛选。Hi188和Lc19在模拟消化和0.3%胆盐胁迫下表现出与LGG相当的胃肠道耐受性。两株菌对结肠类器官的黏附能力显著高于LGG。两株菌均恢复了TNF-α损伤类器官中的紧密连接基因
通过胃肠道（GI）液体耐受性、胆盐抗性、类器官黏附和屏障保护对益生菌进行多维筛选。Hi188和Lc19在模拟消化和0.3%胆盐胁迫下表现出与LGG相当的胃肠道耐受性。两株菌对结肠类器官的黏附能力显著高于LGG。两株菌均恢复了TNF-α损伤类器官中的紧密连接基因；Lc19恢复了Occludin、ZO-1和E-cadherin蛋白。Hi188和Lc19建立了从胃肠道抗性到黏附及屏障保护的功能链条。研究人员建立了整合胃肠道耐受性、胆盐抗性、类器官黏附和屏障保护的多维筛选与功能评价体系，用于候选益生菌菌株的筛选。结果证明，Hi188和Lc19在所有评价参数上均持续表现出与参考菌株LGG相当或更高的水平。在胃肠道适应性方面，模拟胃液和肠液耐受实验揭示了细菌在各自条件下耐受性的差异，反映了菌株对胃肠道环境中不同胁迫的特异性响应。值得注意的是，Hi188和Lc19在整个消化过程中保持了与参考菌株LGG相当的抗性。两株菌在0.3%胆盐条件下也表现出高耐受性，表明其对酸性和胆盐环境均具有稳定抗性。在黏附潜力方面，Hi188和Lc19对结肠类器官的黏附能力显著高于LGG，表明其具有较强的肠道黏附能力。在功能层面，两株菌均显著上调了紧密连接相关基因（ZO-1、MUC-2、E-cadherin和CLDN1）的表达并恢复了Occludin蛋白水平，表明其对TNF-α诱导的上皮屏障破坏具有保护作用。值得注意的是，Lc19对ZO-1和E-cadherin表达的效应更为明显，提示其在维持黏附连接完整性方面可能具有更强的作用。总体而言，Hi188和Lc19在模拟胃液和肠液耐受、胆盐适应、肠道黏附和屏障保护等多个关键阶段表现出一致优势，支持其沿从胃肠道抗性到黏附及功能活性的连续生物学过程发挥作用的能力。然而，研究人员也指出了若干局限性：本研究采用体外消化模型和类器官系统，尽管生理相关性有所提高，但仍不能完全再现体内肠道环境的复杂性；观察到的效应背后的关键功能分子未被直接鉴定，所提出的机制仍有待进一步验证；所有候选菌株均为单独测试，而商业益生菌产品常以多菌株混合制剂形式存在，菌株间的相互作用可能为协同、相加或拮抗，因此Hi188和Lc19与其他菌株联合时的胃肠道存活、黏附和屏障保护效应可能与本文报道的单菌株结果不同，值得直接验证。未来研究应纳入动物模型和临床试验以及多组学方法，以阐明这些益生菌功能的分子基础并支持其在功能性食品和肠道健康干预中的应用。本研究建立了整合胃肠道耐受性、胆盐抗性、类器官黏附和屏障保护的益生菌多维筛选平台。L. plantarum Hi188和L. paracasei Lc19在所有功能参数（包括抗性、黏附和屏障修复）上表现出与参考菌株LGG相当或更好的水平。这些结果将两株菌鉴定为用于肠道健康应用的有前景的益生菌候选菌株。
**研究背景与问题**
人类胃肠道栖息着多样化的微生物群落，在维持肠道稳态、调节宿主代谢和防御病原体方面发挥关键作用。益生菌作为活微生物，在摄入足够量时可赋予宿主健康益处，因其改善肠道健康、增强免疫和缓解炎症性肠病（IBD）及肠易激综合征（IBS）等胃肠道疾病的潜力而受到广泛关注。然而，筛选具有最佳治疗效果的益生菌菌株仍是一个复杂过程，涉及胃肠道抗性、黏附肠道上皮细胞能力以及对肠道炎症和屏障功能障碍的保护效应等多个关键因素。在益生菌筛选中，首先需确保益生菌能承受胃肠道的恶劣环境——胃的酸性环境和小肠对胆盐的耐受性是益生菌成功定植肠道的前提。此外，益生菌黏附肠道上皮细胞的能力是筛选的另一关键特征，有效黏附通常可阻止病原菌附着、避免感染并维持肠道稳态。在已充分表征的益生菌菌株中，鼠李糖乳酪杆菌GG（LGG）是研究最广泛且商业上最成功的益生菌之一，常被用作阳性对照。除胃肠道耐受性和黏附能力外，益生菌的功能特性同样重要，其调节炎症反应和修复肠道屏障的能力是治疗潜力的关键指标。尽管益生菌研究丰富，但仍需更严格和系统化的筛选方法在多维度上评价菌株。许多研究通常仅关注单一特性，但这些因素之间的复杂相互作用需要更全面的筛选策略。此外，先进体外模型（如肠道类器官）提供了更接近生理条件的实验平台，与传统细胞系相比具有更高的生理相关性。因此，本研究旨在通过评估菌株在胃肠道环境中的抗性、对结肠类器官的黏附能力以及在炎症应激下调节炎症反应和修复肠道屏障功能的能力，系统评价这些菌株的益生菌潜力。研究假设，结合这些多维评估方法将能够鉴定具有优异益生菌特性的菌株，并为其进一步临床应用开发奠定基础。
**关键技术方法**
研究人员采用模拟胃肠道消化模型（依次经人工唾液、模拟胃液pH 2.5和模拟肠液处理）评价菌株存活率；采用0.3%（w/v）胆盐胁迫下的生长评价胆盐耐受性；采用人结肠类器官（来源于健康成人供者结肠活检样本，浙江大学医学院附属第一医院提供，传代5–10代）进行黏附实验并以扫描电镜（SEM）观察超微结构；构建TNF-α（60 ng/mL）诱导的类器官损伤模型并以LGG为阳性对照进行干预；采用实时定量PCR（qPCR）检测紧密连接相关基因mRNA表达，Western blot检测ZO-1和E-cadherin蛋白表达，免疫荧光检测Occludin表达与定位。候选菌株共16株（9株乳酸菌和7株双歧杆菌），由蒙牛乳业提供，LGG（ATCC 53103）为参考菌株。
**研究结果**
3.1 菌株在连续消化阶段的抗性评价：通过模拟唾液、胃液和肠液序贯暴露测定所有菌株存活率，发现模拟唾液阶段所有菌株均保持高活力，Hi188和Lc19存活率分别为94.900%和97.483%，与LGG无显著差异；模拟胃液处理后各菌株存活率不同程度下降，但Hi188、MN-Gup、MN00930、Lc19等与LGG无显著差异；模拟肠液处理后存活率进一步下降，但Hi188、Lc19、MN-Gup、MN00927和MN15739等仍保持与LGG相当的存活率。基于此，Hi188、Lc19、MN-Gup、MN00927和MN15739表现出相对较高的胃肠道耐受性。
3.2 候选益生菌菌株胆盐耐受性评价：通过在0.3%胆盐胁迫下测定生长，发现Hi188、Lc19、MN-Gup、MN00927、MN00929、MN00934、MN00941、Fe-01、Ca360和MN15739与LGG无显著差异，被归类为高胆盐耐受菌株，其中Hi188和Lc19抗性最高；少数菌株抗性显著低于LGG。
3.3 候选益生菌菌株对结肠类器官黏附能力评价：通过类器官黏附实验，发现Hi188和Lc19黏附率显著高于LGG；MN-Gup、MN00927等与LGG无显著差异；MN00930、MN17481和MN15965与阴性对照无显著差异，黏附能力较弱。SEM图像定性证实了定量分析观察到的黏附模式。综合体外耐受和功能实验结果表明，Hi188和Lc19在受评价菌株中整体表现优良，二者胃肠道耐受性与LGG相当，同时表现出强胆盐抗性和增强的黏附能力，因此被选为进一步功能表征。
3.4 候选益生菌菌株对TNF-α诱导肠道屏障功能障碍的保护效应：通过qPCR发现TNF-α处理显著下调ZO-1、MUC-2、E-cadherin和CLDN1表达，而Hi188和Lc19均显著上调上述基因mRNA表达，且与LGG无显著差异；免疫荧光显示TNF-α组Occludin荧光强度明显降低，LGG、Hi188和Lc19处理后Occludin表达增加，其中LGG和Lc19荧光强度相对较高，Hi188呈中等程度恢复；Western blot显示TNF-α显著降低ZO-1和E-cadherin蛋白表达，Lc19显著增加两种蛋白表达，Hi188、Lc19与LGG间无显著差异。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究建立了整合模拟胃肠条件耐受性、胆盐抗性、肠道类器官黏附和肠道屏障保护能力的多维筛选与功能评价体系，Hi188和Lc19在所有评价参数上表现与参考菌株LGG相当或更高。胃肠道适应性方面，模拟胃液和肠液耐受实验揭示的菌株特异性响应与既往关于多阶段消化胁迫对益生菌活力协同效应的研究一致；Hi188和Lc19在整个消化过程中保持与LGG相当的抗性，其存活率范围与采用统一INFOGEST静态体外消化模型的研究报道相近。两株菌在0.3%胆盐下高耐受，与乳杆菌通常具有较强膜稳定性和胆盐水解酶（BSH）相关调控机制的既往研究一致；而某些双歧杆菌在联合消化胁迫下抗性显著降低，提示菌属间胃肠道适应机制存在固有差异。黏附方面，Hi188和Lc19对结肠类器官黏附显著高于LGG，乳杆菌黏附由多种表面相关因子介导，包括黏液结合蛋白（MUB）、LPXTG锚定蛋白、S层蛋白和胞外多糖（EPS），某些兼职蛋白（如GAPDH和烯醇化酶）也参与宿主互作，因此其增强的黏附可能与表面分子特征相关。功能层面，两株菌显著上调紧密连接相关基因并恢复Occludin蛋白水平，Lc19对ZO-1和E-cadherin表达效应更明显，提示其在维持黏附连接完整性方面可能作用更强；乳杆菌可调节上皮信号通路（如MAPK）和细胞骨架组织，从而促进紧密连接蛋白表达。此外，微生物代谢物和EPS可能通过增强黏液分泌和调节上皮细胞功能参与屏障维持；近期一项体内研究报告2′-岩藻糖基乳糖与L. plantarum Hi188的合生元组合影响生长中小鼠的骨骼生长和肠道微生物代谢，提示Hi188可能不仅通过直接上皮互作、还通过微生物群和代谢物介导途径参与宿主有益效应。局限性包括：体外消化模型和类器官系统不能完全再现体内肠道环境复杂性；关键功能分子未被直接鉴定，所提机制有待验证；所有候选菌株单独测试，而商业产品常为多菌株混合，菌株间相互作用可能为协同、相加或拮抗，联合效应需直接验证。未来应纳入动物模型、临床试验和多组学方法。结论部分：建立了整合胃肠道耐受性、胆盐抗性、类器官黏附和屏障保护的益生菌多维筛选平台，L. plantarum Hi188和L. paracasei Lc19在所有功能参数上表现与参考菌株LGG相当或更好，包括抗性、黏附和屏障修复，这些结果将两株菌鉴定为用于肠道健康应用的有前景的益生菌候选菌株。
