《Journal of Functional Foods》：Effects of maternal fructose, sucrose, and erythritol exposure on renal development and function in mouse offspring
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母体妊娠期和哺乳期果糖、蔗糖及赤藓糖醇暴露与子代肾脏发育和功能改变相关。肾脏改变在雌雄子代间呈现不同模式。肾脏发育和功能改变主要发生于雄性子代。PLK3及细胞周期阻滞与肾脏改变相关。为探究母体妊娠期和哺乳期摄入果糖、蔗糖及赤藓糖醇对小鼠子代早期及后期肾脏发育和
母体妊娠期和哺乳期果糖、蔗糖及赤藓糖醇暴露与子代肾脏发育和功能改变相关。肾脏改变在雌雄子代间呈现不同模式。肾脏发育和功能改变主要发生于雄性子代。PLK3及细胞周期阻滞与肾脏改变相关。为探究母体妊娠期和哺乳期摄入果糖、蔗糖及赤藓糖醇对小鼠子代早期及后期肾脏发育和功能结局的影响，并探索这些改变背后的潜在分子通路，研究人员将妊娠C57BL/6J小鼠随机分为四组（每组n=6只母鼠），分别自由饮用无菌水（对照）、20%（w/v）果糖、20%（w/v）蔗糖或20%（w/v）赤藓糖醇溶液，并喂食标准饲料。子代在3周龄（断乳）或8周龄时处死。研究人员分别对雄性和雌性sub代进行分析。当同一窝同一性别的多只子代贡献于某一终点时，在统计分析前先窝内平均，以窝作为实验单位。研究人员检测了母体能量代谢、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、血清胰岛素、肾功能及生化指标、肾脏组织学和形态学分析[苏木精-伊红（HE）和过碘酸-雪夫（PAS）染色、透射电子显微镜（TEM）、肾小球密度和面积]、免疫组织化学染色、免疫荧光共定位染色、RNA测序（RNA-seq）分析、Western blots、定量实时PCR（qRT-PCR）、细胞培养和转染、共免疫沉淀（CoIP）及统计学分析。结果显示，妊娠期和哺乳期甜味剂摄入改变了母体能量摄入和母体肾功能。母体甜味剂摄入与3周龄雄性sub代肾小球密度降低和肾功能改变相关。RNA-seq筛选鉴定出PLK3为与3周龄雄性sub代甜味剂相关肾脏改变相关的候选基因。PLK3上调与肾小管G2/M期细胞周期改变相关。PLK3过表达与G2/M期细胞周期改变及p53相互作用相关。母体甜味剂摄入对8周龄雄性sub代肾功能产生持续影响。PLK3上调及G2/M期细胞周期阻滞也与8周龄雄性sub代肾脏改变相关。综上所述，母体妊娠期和哺乳期果糖、蔗糖及赤藓糖醇暴露与小鼠子代肾脏发育和功能改变相关，这些改变在8周龄时仍明显存在，在雄性sub代中更为显著，并伴有PLK3表达增加、DNA损伤相关改变及G2/M期细胞周期阻滞。
研究背景：慢性肾脏病（CKD）的发生发展与生命早期发育编程密切相关。健康与疾病的发育起源（DOHaD）假说指出，妊娠期和哺乳期不良营养环境可通过肾脏编程改变肾脏结构和功能，使子代成年后更易患慢性肾脏疾病。肾单位作为肾脏基本功能单位，主要在胚胎期形成，出生后总数固定。因此，早期发育阶段的不良母体暴露可能影响肾脏发育及后续肾脏健康。越来越多证据表明，母体不健康饮食模式（如高糖、高脂、低蛋白饮食）可降低子代肾单位数量、损害肾小球滤过功能并升高成年期CKD风险，证实母体饮食是肾脏发育编程的关键调节因素。果糖和蔗糖是传统热量甜味剂，赤藓糖醇是低热量糖醇甜味剂。既往研究报道，妊娠期和哺乳期母体过量摄入果糖和蔗糖可诱导成年期肾功能障碍和高血压相关肾损伤，但其对出生后早期肾脏发育的具体影响及精确分子机制尚不清楚。赤藓糖醇已在胎儿循环中检出，但母体赤藓糖醇暴露是否与子代肾脏发育改变相关及其与传统热量甜味剂效应的比较仍不明确。因此，研究人员开展此项研究，探究母体妊娠期和哺乳期果糖、蔗糖及赤藓糖醇摄入对小鼠子代早期和后期肾脏发育及功能结局的影响，并探索潜在分子通路。研究意义在于揭示不同甜味剂母体暴露对子代肾脏发育编程的差异性影响及潜在机制，为生命早期营养干预提供依据。
关键技术方法：研究采用8周龄SPF级雌性C57BL/6J小鼠，与雄性1:1交配，见阴道栓当日中午记为胚胎第0天（E0）。妊娠小鼠随机分为四组（每组n=6只母鼠），妊娠期和哺乳期分别自由饮用无菌水（对照）、20%（w/v）果糖、20%（w/v）蔗糖或20%（w/v）赤藓糖醇溶液，喂食标准饲料。子代于3周龄（断乳）或8周龄处死。主要技术方法包括：口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、血清胰岛素ELISA检测及HOMA-IR计算、代谢笼收集24小时尿液及肾功能生化指标检测、肾脏HE和PAS染色、透射电子显微镜（TEM）观察、免疫组织化学染色、免疫荧光共定位染色、RNA测序（RNA-seq）分析（肾皮质，每组n=3，来自每组三窝）、Western blots、定量实时PCR（qRT-PCR）、HK-2细胞培养及PLK3过表达质粒转染、共免疫沉淀（CoIP）。样本队列来源为C57BL/6J小鼠子代，以窝为实验单位。
研究结果：
3.1 妊娠期和哺乳期甜味剂摄入改变母体能量摄入：通过监测妊娠期母体能量摄入和代谢指标，发现与对照组相比，三个甜味剂组母鼠妊娠期饲料摄入量均减少，果糖和蔗糖组总能量摄入较高而赤藓糖醇组较低；蔗糖组哺乳结束后脂肪量升高，赤藓糖醇组瘦体重降低；果糖和蔗糖组母体碳水化合物摄入较高而蛋白质摄入较低，赤藓糖醇组碳水化合物、蛋白质和脂肪摄入均较低；OGTT显示果糖组15分钟血糖显著高于对照组和蔗糖组，赤藓糖醇组30分钟血糖显著高于蔗糖组，其余时间点无显著差异，空腹血糖、OGTT曲线下面积、空腹胰岛素和HOMA-IR在各组间无显著差异。
3.2 妊娠期和哺乳期甜味剂摄入影响母体肾功能：通过检测哺乳结束时母体肾脏指标和病理改变，发现果糖组母鼠肌酐清除率（Ccr）显著高于对照组和赤藓糖醇组，赤藓糖醇组Ccr显著低于对照组，蔗糖组Ccr无变化；赤藓糖醇组尿IgG显著高于果糖和蔗糖组，但与对照组无显著差异；三个甜味剂组尿Na+和K+水平均显著降低，蔗糖组尿Cl?显著降低；HE染色显示果糖组肾小球增大、肾小管扩张、部分上皮脱落和空泡变性，蔗糖组肾脏形态正常，赤藓糖醇组偶见肾小管上皮脱落但肾小球大小稳定；PAS染色显示所有甜味剂组肾小球基底膜增厚和系膜增生。
3.3 母体甜味剂摄入影响3周龄雄性sub代肾脏发育和功能：通过评估3周龄sub代早期肾脏发育参数，发现各组窝产仔数无显著差异；3周龄时仅赤藓糖醇组雌性sub代体重降低；8周龄时蔗糖和赤藓糖醇组雄性体重低于对照组和果糖组，雌性各组间无显著差异；3周龄雄性各组相对肾重无差异，但所有甜味剂组雄性肾小球密度明显下降，果糖和赤藓糖醇组肾小球面积减小而蔗糖组无显著差异；雌性sub代相对肾重和肾小球密度无显著变化，仅赤藓糖醇组雌性肾小球面积轻度减小；3周龄赤藓糖醇组雄性血清肌酐显著升高，其余组无显著差异，血尿素氮在雌雄sub代中均无显著差异；组织学染色显示果糖和赤藓糖醇组雄性肾小球皱缩，蔗糖和赤藓糖醇组雄性部分肾小球萎缩，三组均见肾小球糖原沉积和系膜扩张，雌性sub代可见类似组织学改变；三个甜味剂组雄性sub代肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL均显著升高。
3.4 PLK3在母体甜味剂暴露后雄性sub代肾脏中持续上调：通过对3周龄雄性肾组织进行RNA-seq分析，比较三个甜味剂组间差异表达基因以鉴定各干预共同改变的基因，Venn分析鉴定出Polo样激酶3（PLK3）为所有干预中持续上调的基因；qRT-PCR和Western blot进一步验证雄性sub代肾脏中PLK3 mRNA和蛋白升高；免疫组织化学显示PLK3主要定位于肾小管上皮细胞胞质和胞核。
3.5 PLK3上调与肾小管G2/M期细胞周期阻滞相关：鉴于PLK3在细胞周期调控中的已知作用，研究人员检测PLK3上调是否与肾小管G2/M期细胞周期改变相关，发现3周龄雄性sub代肾脏中细胞周期相关基因Cyclin B1、CDK1和p21表达改变；Western blot显示三个甜味剂组Cyclin B1、p21和p53蛋白水平升高，CDK1蛋白在蔗糖和赤藓糖醇组降低而果糖组不变；G2/M标志物pH3ser10在肾小管上皮细胞中明显升高；免疫荧光显示PLK3与pH3ser10强共定位。
3.6 PLK3过表达与G2/M期细胞周期改变及p53相互作用相关：为探索PLK3上游调控，研究人员检测DNA损伤相关蛋白ATM和γH2AX，发现两者在所有甜味剂组均显著升高，免疫组织化学显示γH2AX主要定位于肾小管上皮细胞；为进一步检验PLK3表达与G2/M期细胞周期调控的关系，在HK-2细胞中过表达PLK3，发现PLK3过表达增加Cyclin B1、p21和p53并降低CDK1，pH3ser10也上调，PLK3-pH3ser10共定位增强；通过STRING数据库预测PLK3相互作用伙伴并鉴定p53为候选分子，共免疫沉淀实验进一步验证肾小管上皮细胞中PLK3与p53的物理相互作用。
3.7 母体甜味剂摄入对8周龄雄性sub代肾功能产生持续影响：通过进一步研究8周龄sub代，发现所有甜味剂组雄性肾小球密度和面积均减小，Ccr均显著低于对照组；赤藓糖醇组尿IgG、总蛋白和NAG显著升高，果糖和蔗糖组与对照组无显著差异，赤藓糖醇组尿NAG显著高于果糖、蔗糖和对照组；尿钠和钾排泄各组间无显著差异；8周龄雌性sub代各肾脏参数与对照组无显著差异，但赤藓糖醇组尿NAG高于果糖组；HE染色显示8周龄雄性治疗组肾小球皱缩，PAS染色显示甜味剂组肾小球病变；TEM显示各干预组肾小球超微结构损伤和共同肾小管线粒体病变，果糖组见基底膜断裂和足突融合，蔗糖组见轻度足突异常，赤藓糖醇组见基底膜变窄和足突消失，雌性未见明显肾脏结构损伤。
3.8 PLK3上调及G2/M期细胞周期阻滞也与8周龄雄性sub代肾脏改变相关：通过评估8周龄雄性sub代肾脏损伤指标和PLK3相关细胞周期分子，发现肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL在所有甜味剂组持续升高；PLK3在蔗糖和赤藓糖醇组持续上调但在果糖组恢复正常；DNA损伤相关ATM和γH2AX在蔗糖和赤藓糖醇组持续升高而非果糖组，免疫组织化学验证一致；Cyclin B1和CDK1仅在赤藓糖醇组降低，p53、p21和pH3Ser10在蔗糖和赤藓糖醇组升高而果糖组无显著变化；pH3ser10表达升高和PLK3-pH3ser10共定位在两个组进一步确认。
讨论部分总结：热量甜味剂与代谢/肾脏疾病的联系推动了赤藓糖醇等低热量替代品的发展。本研究中，母体妊娠期和哺乳期果糖、蔗糖及赤藓糖醇暴露与子代肾脏发育和功能改变相关，包括肾小球密度降低、肾脏结构和功能改变、DNA损伤相关信号改变、PLK3表达改变及G2/M期细胞周期调控改变，部分改变在雌雄sub代中均可见，其他主要见于雄性。与DOHaD框架一致，母体甜味剂暴露与幼年雄性sub代肾小球密度降低相关，8周龄时也可见类似改变。肾单位数量在发育受限期内确立，该期紊乱可能对肾脏结构和功能产生持久影响。这些发育异常可能部分归因于甜味剂介导的母体营养失衡，尤其是食物和蛋白质摄入减少。此外，果糖可能通过诱导尿酸蓄积和胎盘氧化应激独特地干扰胚胎肾脏发育，解释其独特的早期发育毒性。机制上，转录组分析鉴定PLK3为所有甜味剂干预共同的差异表达基因。DNA损伤相关蛋白ATM和γH2AX表达升高伴随PLK3上调，提示DNA损伤相关信号可能参与观察到的肾脏PLK3表达升高。然而，本研究未直接操纵ATM/γH2AX通路，因此无法确定该关系的方向性。PLK3表达在肾小管上皮细胞中升高并与G2/M期细胞周期相关蛋白改变相关。体外PLK3过表达伴随Cyclin B1、p21和p53表达升高、CDK1表达降低及pH3Ser10水平升高，共免疫沉淀支持PLK3与p53的物理相互作用。总之，这些发现提示PLK3及其与p53的相互作用可能参与母体甜味剂暴露后G2/M期细胞周期改变的调控。然而，由于未进行PLK3功能缺失或挽救实验，本研究未确立PLK3在观察到的肾脏表型中的因果或必要作用。三种甜味剂在8周龄时显示不同的肾脏改变模式。果糖组中3周龄时观察到的一些DNA损伤和细胞周期相关改变在8周龄时不再明显，而蔗糖和赤藓糖醇组中PLK3、DNA损伤相关标志物及多种G2/M相关蛋白仍改变。8周龄时赤藓糖醇暴露雄性sub代还显示尿IgG、总蛋白和NAG较对照组升高，并伴肾脏结构改变。这些发现表明在本研究特定暴露条件下肾脏表型在不同甜味剂组间存在差异。蔗糖和赤藓糖醇暴露雄性sub代在8周龄时表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，成年期胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受可能协同加重肾脏恶化，而果糖暴露sub代维持正常代谢稳态。与既往研究一致，蔗糖暴露sub代代谢编程改变与肝脏信号紊乱和胰岛发育受损密切相关。肾脏改变模式在雌雄sub代间存在差异，部分改变在两种性别中均检测到，其他主要见于雄性。这种性别二态性可能源于固有宫内发育差异和激素介导的肾脏调控。雌激素在雌性中赋予肾脏保护作用，而睾酮增加雄性对发育损伤的易感性。本研究中母体妊娠期和哺乳期甜味剂暴露导致哺乳结束时异质性肾脏改变。果糖增加Ccr而赤藓糖醇降低Ccr。所有甜味剂组尿钠和钾降低，各甜味剂组间肾脏功能改变存在差异。既往毒理学、生殖和发育研究普遍报道赤藓糖醇在所测条件下不良反应有限。长期和亚慢性研究报道肾脏组织病理学发现有限，尽管在某些暴露条件下观察到尿液改变和骨盆肾钙质沉着。妊娠期和两代研究同样报道在所测剂量下对胎儿发育、生育力或生殖结局无主要不良影响。Chukwuma等也报道赤藓糖醇在2型糖尿病大鼠中的代谢效应。与这些研究相比，本研究涉及妊娠期和哺乳期 substantially 更高的母体暴露，估计赤藓糖醇摄入量为43.49 ± 2.05 g/kg/day。剂量、暴露窗口、发育阶段和结局指标的差异可能导致本研究中观察到的不同发现。本研究存在若干局限性。第一，暴露范式代表极高剂量实验模型，限制直接转化至人类消费。第二，母体膳食摄入和营养组成组间不同，缺乏配对喂养对照无法排除营养因素对子代肾脏表型的潜在贡献。第三，由于母体甜味剂暴露贯穿妊娠期和哺乳期，无法区分妊娠期与哺乳期暴露的相对贡献以及母体生理和乳汁成分变化。第四，机制分析主要在雄性sub代中进行，雌性中是否发生类似分子改变尚不清楚。最后，母鼠/窝水平有效样本量相对较小，尤其对于某些机制分析，尽管统计前已对同窝sub代进行平均，仍可能限制统计效力。
研究结论翻译：简言之，母体妊娠期和哺乳期果糖、蔗糖及赤藓糖醇暴露与小鼠子代肾脏发育和功能改变相关，肾脏改变在8周龄时仍明显存在。这些改变在雄性sub代中更为显著，并伴有PLK3表达增加、DNA损伤相关改变及G2/M期细胞周期阻滞。
