《Journal of Functional Foods》：Water-soluble tomato concentrate as a natural modulator of angiogenesis: Integrated
in vitro and
in ovo evidence
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水溶性番茄浓缩物（water-soluble tomato concentrate）因其心血管保护特性而受到认可，其抗血小板特性已被充分研究并获得欧洲食品安全局（EFSA）批准用于正常血小板聚集的管理。水溶性番茄浓缩物含有多种生物活性化合物，包括核苷酸、酚酸以
水溶性番茄浓缩物（water-soluble tomato concentrate）因其心血管保护特性而受到认可，其抗血小板特性已被充分研究并获得欧洲食品安全局（EFSA）批准用于正常血小板聚集的管理。水溶性番茄浓缩物含有多种生物活性化合物，包括核苷酸、酚酸以及主要以槲皮素衍生物为主的黄酮类化合物，这些成分共同参与其多样的生物学活性。既往研究表明，水溶性番茄浓缩物在大鼠心肌细胞中对抗化疗诱导的细胞毒性发挥心脏保护作用，并在高脂饮食诱导的血脂异常大鼠中促进心脏保护。尽管水溶性番茄浓缩物的心脏保护和抗血小板作用已被充分研究，且主要集中于改善血流、血小板功能和抗血栓形成，但其在血管修复和内皮生长中的作用——这些是心血管疾病管理中的关键过程——仍未得到充分探索。因此，本研究旨在通过检测水溶性番茄浓缩物对人脐带来源内皮细胞（HUVECs）和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）的影响，探讨其促血管生成作用。研究采用MTT法评估细胞活力，AO-EtBr染色检测凋亡，DCFH-DA染色检测活性氧（ROS），Matrigel管形成实验评估体外血管生成，qPCR检测促血管生成基因表达，并采用CAM实验进行体内血管生成评估，结合H&E、PAS和Masson三色染色进行组织学分析。结果表明，水溶性番茄浓缩物在各测试浓度下均不诱导细胞毒性，反而显著增强HUVEC活力；AO/EtBr染色证实其不诱导凋亡；在较低浓度（100-250 μg/mL）下减少细胞内ROS积累；显著促进毛细血管样网络形成，增加节点、网孔和节段数量；显著上调VEGF-A和PECAM-1基因表达，而ENDOGLIN表达在低浓度下下调但随剂量增加逐渐恢复；CAM实验中100-500 μg/mL处理组血管密度显著增加，但1000 μg/mL组血管密度下降且血管完整性受损；组织学分析证实有效浓度下血管形态保存良好、基底膜完整、血管周围胶原沉积有序。研究提示水溶性番茄浓缩物可能通过调控血管生成信号通路发挥促血管生成和细胞保护特性，但需进一步的临床前和临床研究验证其治疗相关性和长期效果。
心血管疾病尤其是缺血性心脏病和外周血管疾病严重影响人类健康。血管生成在缺血性心脏疾病如冠状动脉疾病、卒中及伤口愈合不良中发挥心脏保护作用，这些疾病中血流受限、组织缺氧。生长因子如VEGF和EGF已被用于刺激血管生长，在治疗缺血性心脏疾病方面具有潜力。传统药物如β受体阻滞剂、ACE抑制剂、钙通道阻滞剂、抗血小板药物或抗凝剂通常通过调节心率、舒张血管、减少斑块/血栓/胆固醇积累来降低风险，但不能有效修复或替换受损血管。外周血管疾病导致严重肢体缺血，常规药物如阿司匹林、西洛他唑或他汀类药物存在肌肉和肝脏损伤、胃肠道出血或溃疡等副作用，即使手术血运重建也可能仅实现60-80%的功能恢复，并可能导致术后并发症。治疗性血管生成是诱导内源性血管发生和恢复缺血组织血液灌注的有前景方法，VEGF和HGF基因治疗是仅有的两种获批临床使用的疗法。天然化合物多被研究其抗癌治疗中的抗血管生成特性，但多种天然产物通过调节缺氧反应或内皮信号通路促进血管生成，如白藜芦醇以FOXO1依赖方式促进血管生成并刺激eNOS增加NO水平，姜黄素通过诱导VEGF表达促进血管生成，人参皂苷和黄芪甲苷刺激VEGF和血管生成素表达促进血管再生，生物碱和酚酸也支持新血管形成并保护内皮细胞免受氧化应激。水溶性番茄浓缩物因其心血管保护特性而受到认可，其抗血小板特性已被充分研究并获得EFSA批准用于正常血小板聚集管理。水溶性番茄浓缩物含有多种生物活性化合物，包括核苷酸、酚酸和以槲皮素衍生物为主的黄酮类化合物。既往研究显示水溶性番茄浓缩物在大鼠心肌细胞中对抗化疗诱导的细胞毒性发挥心脏保护作用，并在高脂饮食诱导的血脂异常大鼠中促进心脏保护。尽管水溶性番茄浓缩物的心脏保护和抗血小板作用已被充分研究，主要集中于改善血流、血小板功能和抗血栓形成，但其在血管修复和内皮生长中的作用仍未充分探索。因此，本研究旨在通过检测水溶性番茄浓缩物对HUVECs和鸡胚CAM的影响，探讨其促血管生成作用。
研究人员开展了体外和体内整合研究，采用HUVECs和鸡胚CAM模型评估水溶性番茄浓缩物的促血管生成潜力。结论表明水溶性番茄浓缩物可能具有促血管生成和细胞保护特性，可增强内皮细胞稳态而不诱导细胞毒性，支持内皮完整性和功能的维持；通过减少过量ROS至生理最佳水平维持细胞内氧化还原平衡；上调VEGF-A、PECAM-1和ENDOGLIN等关键血管生成和内皮标志物；管形成实验和CAM实验的功能证据支持其刺激血管网络形成和成熟的能力。该研究的重要意义在于首次为水溶性番茄浓缩物在血管修复和内皮生长方面的作用提供了实验证据，填补了对其生物学活性理解的重要空白，提示其可能在缺血性和心血管疾病中促进血管修复，为开发基于天然产物的促血管生成治疗策略提供了科学依据。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：MTT法评估HUVEC细胞活力；AO-EtBr双染检测凋亡；DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平；Matrigel管形成实验评估体外血管生成能力；qPCR检测促血管生成基因（VEGF-A、PECAM-1、ENDOGLIN）mRNA表达；鸡胚CAM实验评估体内血管生成；H&E、PAS和Masson三色染色进行组织学分析。HUVECs购自HiMedia（India），鸡胚受精蛋购自当地家禽养殖场。
研究结果如下：
3.1 通过MTT法检测细胞活力：水溶性番茄浓缩物在10-1000 μg/mL浓度范围内处理48和72 h后，各浓度组均未显示细胞毒性，且与未处理对照组相比显著增加HUVEC活力。48 h时，25 μg/mL（p < 0.05）和50 μg/mL（p < 0.01）显著增加细胞活力，250和500 μg/mL也显著增加（p < 0.01），1000 μg/mL有中度但显著的增加（p < 0.05）。72 h时，10、25、100 μg/mL（p < 0.05）及250、500 μg/mL（p < 0.01）均显著增加细胞活力。表明水溶性番茄浓缩物可促进内皮细胞增殖。
3.2 通过AO-EtBr染色检测凋亡：未处理对照组显示正常细胞形态，H&sub2;O&sub2;阳性对照组显示红色细胞核增加伴细胞皱缩，证实凋亡诱导。水溶性番茄浓缩物各测试浓度组几乎未见红色细胞核，细胞形态正常，AO阳性活细胞遍布所有处理组，表明其在HUVECs中细胞毒性较低。
3.3 通过DCFH-DA染色检测细胞内ROS积累：未处理对照组显示低基础绿色荧光，H&sub2;O&sub2;阳性对照组显示较高绿色荧光证实ROS生成。100和250 μg/mL水溶性番茄浓缩物处理组细胞内ROS水平较低，提示这些浓度下ROS积累减少；500和1000 μg/mL组ROS轻度增加。表明水溶性番茄浓缩物不诱导HUVECs氧化应激，100-250 μg/mL效果最显著。
3.4 通过管形成实验评估体外血管生成：未处理对照组HUVECs形成基础管状网络，水溶性番茄浓缩物处理增强毛细血管网络样形成和内皮组织化。100 μg/mL组网络形成中度改善，250和500 μg/mL组变化更显著。节点数在所有处理组均高于对照组，500 μg/mL增加最明显；网孔数在250 μg/mL显著增加（p < 0.01），100和500 μg/mL也有改善（p < 0.05）；节段数随处理逐渐增加，250 μg/mL（p < 0.05）和500 μg/mL（p < 0.01）有统计学显著增加。表明水溶性番茄浓缩物促进内皮细胞迁移和血管网络复杂性。
3.5 通过qPCR检测促血管生成基因相对表达：水溶性番茄浓缩物处理HUVECs后，PECAM-1和VEGF-A呈剂量依赖性显著上调；ENDOGLIN表达较对照组下调，但随处理剂量增加而恢复上调。250和500 μg/mL促血管生成反应明显，支持确定水溶性番茄浓缩物介导血管生成调节的最佳浓度。
3.6 通过CAM实验评估体内血管生成：100、250和500 μg/mL水溶性番茄浓缩物处理组血管密度显著增加，但1000 μg/mL高浓度组血管密度显著下降。
3.7 通过组织学染色评估血管形态和结构：H&E染色显示对照和溶剂对照组血管结构组织良好、边界清晰、细胞衬里连续；100和250 μg/mL组血管边界清晰、血管衬里发育良好且连续；500 μg/mL组血管衬里保存良好；1000 μg/mL组血管组织减少，部分血管壁衬里边界不清、不规则或中断，提示该极高浓度下血管完整性受损和可能的内皮衬里损伤。PAS染色显示对照和溶剂对照组血管周围PAS阳性边界清晰连续均匀；100和250 μg/mL组PAS阳性区域清晰可见且基本连续，250 μg/mL组组织良好；500 μg/mL组PAS阳性边界在某些区域不太突出；1000 μg/mL组PAS阳性血管边界不规则且不清晰，部分区域不连续，表明基底膜相关结构紊乱。Masson三色染色显示对照和溶剂对照组血管周围有明显胶原层；100和250 μg/mL组血管周围可见清晰胶原层；250和500 μg/mL组胶原沉积清晰可辨；1000 μg/mL组血管结构周围胶原沉积仍然明显，与H&E和PAS在该浓度观察到的血管形态改变不同，Masson三色染色证实血管周围胶原性ECM持续存在。
讨论部分总结：本研究观察到的内皮功能、氧化平衡、血管重塑和成熟等综合效应提示水溶性番茄浓缩物可能有助于维持健康的血管环境，支持组织修复和生理适应。血管生成效应可能与水溶性番茄浓缩物中主要生物活性组分的联合作用有关而非单一化合物。核苷衍生物 particularly 腺苷可能通过腺苷受体介导途径和VEGF调节参与血管生成信号传导；酚类化合物如绿原酸通过调节氧化应激对内皮细胞发挥保护作用；黄酮类衍生物如槲皮素通过抗氧化和抗炎机制 contribute 内皮保护。本研究为水溶性番茄浓缩物的促内皮和促血管生成效应提供了实验证据，填补了对其生物学活性理解的重要空白。细胞活力实验显示水溶性番茄浓缩物不诱导HUVECs细胞毒性反而增强细胞活力，提示促进内皮细胞增殖的潜在作用，AO/EtBr染色进一步证实其无细胞毒性。氧化应激在内皮功能障碍和血管生成受损中起核心作用，过量ROS降低NO生物利用度破坏血管稳态，而受控的ROS生成可促进血管生成信号传导。本研究显示水溶性番茄浓缩物在较低浓度下通过限制过量ROS积累维持细胞内氧化还原平衡，较高浓度下ROS适度增加提示可能的毒物兴奋效应促进血管生成信号传导。管形成实验证实水溶性番茄浓缩物显著增强HUVECs毛细血管样网络形成，节点、网孔和节段数增加，表明内皮组织化和功能性血管生成能力改善。分子水平上，水溶性番茄浓缩物显著上调VEGF-A、PECAM-1和ENDOGLIN等关键血管生成标志物。VEGF-A是血管生成的核心介质，促进内皮增殖、迁移和尖端细胞形成；PECAM-1支持内皮细胞黏附和血管完整性；ENDOGLIN（CD105）是增殖内皮细胞高表达的跨膜糖蛋白，作为TGF-β信号辅助受体调节内皮增殖、迁移、分化和血管重塑。本研究观察到的VEGF-A和PECAM-1上调进一步支持其促血管生成潜力。有趣的是，ENDOGLIN表达在低浓度下显著下调但随剂量增加逐渐恢复，这种差异调节提示水溶性番茄浓缩物可能选择性激活VEGF依赖的血管生成信号而同时减弱TGF-β/endoglin通路。ENDOGLIN表达增加常与病理性血管生成、肿瘤新血管形成和血管纤维化相关，因此尽管管形成、CAM血管化和VEGF-A/PECAM-1强烈诱导增强，ENDOGLIN表达降低提示水溶性番茄浓缩物促进更生理性的血管生成反应而限制内皮过度激活。CAM实验进一步验证了体外发现的促血管生成效应，组织学分析证实血管形成增加、胶原沉积和基底膜完整性，表明血管发育和成熟改善。研究局限性包括仅评估了体外HUVEC和体内CAM模型，不能完全复制哺乳动物血管生理复杂性；分子分析仅限于选定血管生成标志物；ENDOGLIN下调需进一步研究TGF-β/SMAD通路包括ALK1/ALK5信号；血管生成基因表达仅在mRNA水平评估而无蛋白表达或磷酸化分析；CAM组织学评估主要为定性，未来需定量形态学分析、临床前哺乳动物模型和临床研究验证治疗相关性、安全性和长期效果。
研究结论翻译：本研究提示水溶性番茄浓缩物在内皮细胞中可能具有促血管生成和细胞保护特性，如体外实验所观察到的。研究结果表明水溶性番茄浓缩物可增强内皮细胞稳态而不诱导细胞毒性，支持内皮完整性和功能的维持。水溶性番茄浓缩物似乎通过减少过量ROS至生理最佳水平来维持细胞内氧化还原平衡，从而最小化氧化应激同时保留正常内皮功能所需的氧化还原信号传导。除抗氧化效应外，水溶性番茄浓缩物上调关键血管生成和内皮标志物包括VEGF-A、PECAM-1（CD31）和ENDOGLIN，这些是内皮增殖、迁移和新血管形成的关键调节因子。管形成实验和CAM实验的功能证据进一步支持其刺激血管网络形成和成熟的能力，提示可能影响血管生成的生理过程。当前实验研究表明水溶性番茄浓缩物的组分可能通过血管生成信号通路调节血管生成。尽管这些发现令人鼓舞，但主要基于体外和体内实验模型。需要进一步的临床前和精心设计的临床研究来确定这些机制是否能转化为对人类血管再生、内皮功能和健康老龄化的有意义益处，并建立最佳给药策略和评估长期疗效。
