聚合物调控的高孔隙金电极上果糖脱氢酶生物电催化实现发酵液中直接电子转移果糖传感

《ChemElectroChem》：Polymer-Modulated Fructose Dehydrogenase Bioelectrocatalysis on Highly Porous Gold Electrodes for Direct Electron Transfer Fructose Sensing in Fermentation Broth

　　

本研究开发了一种安培型果糖生物传感器，通过将果糖脱氢酶（FDH）固定于经聚合物中间层修饰的高孔隙金（h-PG）电极上。采用聚丙烯酸（PAA）、聚乙烯醇（PVA）和聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）调控酶–电极界面，构建了h-PG/PAA/FDH、h-PG/PVA/FDH和h-PG/PDDA/FDH生物电极。通过氢气泡辅助电沉积制备的h-PG层具有18–46 μm的孔道、纳米珊瑚状金特征以及26 ± 3 cm²的电活性面积，约为裸金的300倍。扫描电子显微镜（SEM）、循环伏安法和X射线光电子能谱（XPS）证实了多孔形貌和聚合物沉积。聚合物界面调控FDH生物电催化行为。h-PG/PAA/FDH表现出最低的果糖氧化起始电位（?0.063 ± 0.005 V）以及在+0.205 V、10 mM D-果糖条件下最高的催化电流（32 ± 4 μA）。安培法给出0.02–1 mM的线性范围、表观米氏常数（K_M^app）= 6.4 ± 0.8 mM、灵敏度6.4 ± 0.2 μA mM^?1以及检出限（LOD）5 μM。h-PG/PAA/FDH在发酵液中180天后仍保留其初始响应的95%，并实现了氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）培养过程中果糖的监测。上述结果确定PAA为所研究对象中最有效的中间层，可用于FDH稳定化、直接电子转移（DET）以及在复杂发酵液基质中果糖传感的较低起始电位（E_onset）。

研究背景方面，第三代生物传感器和生物燃料电池的发展推动了对氧化还原酶与电极之间直接电子转移（DET）反应的深入研究，提高DET效率可获得更灵敏的生物传感器和更高效的生物燃料电池。为增强DET反应，大量工作致力于电极表面的纳米结构化以扩大电活性表面积，从而提高酶负载量并支持化学修饰。多孔金（PG）微纳结构可通过模板法和自模板法电沉积制备，其中氢气泡辅助电沉积可直接产生具有微米级传输孔道与纳米级金特征的分级高孔隙金（h-PG）结构。h-PG电极具有更大的微米级孔道，相比常规纳米多孔金电极可显著提高表面积和电流密度。然而，酶在电极表面的取向对其与换能器之间的电子传递效率具有关键影响，聚电解质可通过长程库仑力与酶相互作用，影响酶的溶解性、催化活性、配体结合及氧化还原电位，并可改变酶构象从而稳定酶并优化其在电极表面的取向。目前针对不同聚合物中间层如何调控h-PG电极上FDH的直接电子转移及在复杂发酵液基质中的长期稳定性，尚缺乏系统研究。基于此，研究人员设计了三种聚合物（PAA、PVA、PDDA）修饰的h-PG电极，固定来源于Gluconobacter japonicus的FDH，构建安培型果糖生物传感器，旨在实现对工业发酵过程中果糖的在线监测，并系统比较不同聚合物界面対FDH生物电催化行为、分析性能和长期稳定性的影响。研究结论表明，PAA界面提供了最有利的FDH介导果糖氧化构型，h-PG/PAA/FDH具有最低起始电位、最高催化电流、最低K_M^app、最高灵敏度和最优长期稳定性，在发酵液中180天保留95%初始电流，并可用于真实果汁样品中果糖的可靠定量，为复杂生物加工环境中稳健的无介体果糖监测提供了有前景的平台。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用氢气泡辅助电沉积法在polycrystalline金电极上制备h-PG层，并通过循环伏安法在H₂SO₄中活化；通过滴涂法依次将聚合物溶液和FDH固定于电极表面；采用扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS）进行形貌与表面化学表征；采用石英晶体微天平（QCM）定量聚合物吸附质量；通过循环伏安法和安培法进行生物电催化与分析性能表征；以氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）ATCC 9844在含甘露醇培养基中培养产生果糖的发酵液作为复杂基质进行稳定性评价，并与商业酶法测定试剂盒（K-FRUGL 06/23，Megazyme）进行对比；此外还对苹果汁、番茄汁和橙汁等真实果汁样品进行了分析验证。

研究结果方面，3.1 高孔隙金电极的形貌与XPS表征：通过SEM量化了氢气泡辅助电沉积所得h-PG层的形貌，显示为具有多峰孔径分布（18–46 μm）的连续多孔金沉积层，孔壁含平均长度0.6 ± 0.1 μm、平均直径100 ± 20 nm的纳米珊瑚状金特征，实现了微米级传输通道与纳米级酶吸附特征的结合；由Au氧化物还原峰电荷计算得h-PG真实电活性面积为26 ± 3 cm²，裸金为0.09 ± 0.01 cm²，增大约300倍；扫描速率依赖的循环伏安法表明聚合物功能化未显著改变h-PG的电化学可及表面积；QCM分析证实h-PG上聚合物吸附量较平面金显著增加，PAA、PVA、PDDA的绝对共振频率位移从平面金上约13、11、16 Hz增至h-PG上约40、34、48 Hz，对应质量负载从约160–190 ng cm^?2增至约430–590 ng cm^?2；XPS宽扫描和高分辨C1s谱证实了聚合物涂覆及相应官能团，聚合物浇铸后碳、氧信号增强而金信号相应降低，同时检测到来自电沉积模板NH₄Cl残留的氮和氯。3.2 FDH生物功能化电极的生物电催化表征：通过循环伏安法在无和有10 mM D-果糖条件下评价三种电极，发现PAA、PVA、PDDA因界面电荷不同而调控FDH的DET生物电催化行为；在pH 5时FDH（pI约6.6）带净正电荷，PAA含部分去质子化羧酸基团，PVA为非离子型富羟基聚合物，PDDA为阳离子型；h-PG/PAA/FDH在无转换条件下显示两对氧化还原峰（E^0′分别为0.075 ± 0.004 V和0.266 ± 0.006 V，归属heme c2和heme c1），加入果糖后催化波起始于E_onset = ?0.063 ± 0.005 V，在+0.205 V达到32 ± 4 μA，为三种聚合物修饰平台中催化电流最高、起始电位最负者，归因于部分去质子化PAA羧酸基团与FDH正电荷区域（尤其CYT_FDH结构域）之间的吸引相互作用；h-PG/PVA/FDH的E_onset = ?0.048 ± 0.009 V，在+0.300 V达到28 ± 2 μA，归因于PVA涂层与CYT_FDH结构域间形成氢键；h-PG/PDDA/FDH的E_onset = ?0.031 ± 0.007 V，在+0.308 V达到26 ± 2 μA，其较正起始电位和较低催化电流与较小或耦合效率较低的电活性FDH群体一致；对照h-PG/FDH仅显示高达1.6 ± 0.2 μA的电催化波；转换循环伏安表明E_onset按PAA < PVA < PDDA顺序增大，与酶分子取向相关。3.3 FDH生物功能化电极的安培表征：在受控扩散和400 rpm搅拌下进行安培测量，用表观Michaelis–Menten方程拟合全浓度曲线获得I_max和K_M^app，低浓度区线性回归获得灵敏度、线性范围和LOD；h-PG/PAA/FDH线性范围0.02–1 mM，I_max = 44 ± 3 μA，K_M^app = 6.4 ± 0.8 mM，灵敏度6.4 ± 0.2 μA mM^?1，LOD = 5 μM，相较h-PG/PVA/FDH的K_M^app低35%、灵敏度高21%，相较h-PG/PDDA/FDH的K_M^app低27%、I_max高51%、灵敏度高83%；h-PG/PVA/FDH的I_max = 42 ± 2 μA，K_M^app = 9.8 ± 0.8 mM，灵敏度5.3 ± 0.2 μA mM^?1，LOD = 7 μM；h-PG/PDDA/FDH的I_max = 28.9 ± 0.6 μA，K_M^app = 8.8 ± 0.4 mM，灵敏度3.5 ± 0.1 μA mM^?1，LOD = 8 μM；三种电极线性范围相似（h-PG/PAA/FDH为0.02–1 mM，另两者为0.03–1 mM），表明聚合物化学主要影响电流尺度、K_M^app和LOD而非线性响应浓度区间，静电相互作用和氢键影响K_M^app值。3.4 发酵液和食品样品中的稳定性：在含甘露醇、酵母提取物、蛋白胨及G. oxydans等的发酵液中评价稳定性，归一化电流响应涵盖酶失活、酶脱附、基质污染、离子强度等因素；h-PG/PAA/FDH在发酵液中180天后保留95%初始响应（180天损失5%），与CV和安培数据一致；h-PG/PVA/FDH 40天后保留约85%；h-PG/PDDA/FDH前10天响应下降约25%并在随后60天继续下降，稳定性趋势为h-PG/PAA/FDH > h-PG/PVA/FDH > h-PG/PDDA/FDH，与灵敏度和CV电流趋势一致；基于E_onset、催化电流、灵敏度、LOD、K_M^app和180天95%电流保留等指标选择h-PG/PAA/FDH用于发酵液测量，并在1:200稀释发酵液中每6 h与商业酶法测定对比监测果糖生成；在苹果汁、番茄汁和橙汁中，生物传感器测得果糖浓度分别为1730 ± 20、1510 ± 40和1680 ± 30 mmol L^?1，与参考方法值1810 ± 10、1420 ± 30和1740 ± 10 mmol L^?1吻合良好，回收率95.6%–106.3%，仅番茄汁因酸性环境导致FDH失活而出现正偏差；与近8年报道的FDH基DET生物传感器比较，本系统具有竞争力，其主要优势在于无介体操作、高孔隙金结构与优异长期稳定性的结合。

讨论部分总结：本研究评估了PAA、PVA和PDDA三种聚合物中间层对h-PG电极上FDH固定化、生物电催化响应和稳定性的影响，证实电极表面暴露的官能团影响FDH生物电催化响应，PAA界面因部分去质子化羧酸基团与pH 5下带正电荷FDH之间的静电相互作用而提供最有利的FDH介导果糖氧化构型；安培校准证实相同趋势，聚合物层主要影响电连接FDH的比例和表观酶–电极耦合而非分析响应浓度范围；发酵液稳定性测量确定h-PG/PAA/FDH为最稳定构型，表明FDH/PAA/h-PG界面可用于食品样品中果糖检测并在发酵液基质条件下维持FDH活性和电子传递能力。研究结论翻译：本研究评估了三种聚合物中间层PAA、PVA和PDDA对h-PG电极上FDH固定化、生物电催化响应和稳定性的影响。氢气泡辅助电沉积制备的h-PG电极具有18–46 μm的孔道和平均长度0.6 ± 0.1 μm、直径100 ± 20 nm的纳米珊瑚状金特征，电活性面积从裸金的0.09 ± 0.01 cm²增至h-PG的26 ± 3 cm²，增大约300倍。电极表面暴露的官能团影响FDH生物电催化响应。h-PG/PAA/FDH在10 mM D-果糖存在下表现出最低起始电位E_onset = ?0.063 ± 0.005 V和最高催化电流32 ± 4 μA（+0.205 V）；h-PG/PVA/FDH和h-PG/PDDA/FDH在更高施加电位下分别显示较低的催化电流28 ± 2和26 ± 2 μA。因此PAA界面为FDH介导的果糖氧化提供了最有利构型，这与pH 5下部分去质子化羧酸基团与带正电荷FDH之间的静电相互作用一致。安培校准证实相同趋势：h-PG/PAA/FDH的K_M^app = 6.4 ± 0.8 mM、I_max = 44 ± 3 μA、线性范围0.02–1 mM、灵敏度6.4 ± 0.2 μA mM^?1、LOD = 5 μM；灵敏度在h-PG/PVA/FDH降至5.3 ± 0.2 μA mM^?1、在h-PG/PDDA/FDH降至3.5 ± 0.1 μA mM^?1；三种电极线性范围保持相似，表明聚合物层主要影响电连接FDH的比例和表观酶–电极耦合而非分析响应浓度范围。在发酵液中进行的稳定性测量确定h-PG/PAA/FDH为最稳定构型，PAA修饰电极180天后保留95%初始电流，而h-PG/PVA/FDH 40天后保留约85%，h-PG/PDDA/FDH信号下降最大。上述数据表明FDH/PAA/h-PG界面可用于食品样品中果糖检测，并在发酵液基质条件下维持FDH活性和电子传递能力。