ONNO型Salophen席夫碱金属配合物的细胞毒性活性与分子对接研究

《ChemistryOpen》：Cytotoxic Activity and Molecular Docking Studies of ONNO Type Salophen Schiff Base Metal Complexes

　　

一种席夫碱配体（H₂L）通过3,5-二溴-2-羟基苯甲醛与1,2-苯二胺缩合合成，随后与Cu(II)、Ni(II)、Pt(II)、Fe(II)和Pd(II)离子配合。合成的化合物通过FT-IR、UV–Vis、NMR、质谱、元素分析、摩尔电导率和磁化率进行表征。H₂L及过渡金属配合物针对人肝癌（HepG2）和肺腺癌（A549）细胞系进行了细胞毒性活性潜力测试。化合物的细胞毒性活性依据其IC₅₀值确定。Pt(II)配合物对HepG2和A549细胞系均表现出高细胞毒性活性，IC₅₀值分别为13.32和12.26 μM。相比之下，Ni(II)和Fe(II)配合物表现出相对较弱的细胞毒性效应。PtL配合物的几何构型通过密度泛函理论（DFT）计算进行优化。分子对接研究用于阐明优化后的PtL配合物与蛋白BCL-2（PDB ID: 6QGK）活性位点之间的非共价相互作用，该蛋白被选为与HepG2细胞相关的推定分子靶点，对接使用PtL的DFT优化几何构型进行。

**研究背景与问题**

无机化合物在医学中的应用可追溯至5000多年前，但以合成新型抗癌药物为目标的研究直至近年才得以发展。癌症发生于细胞DNA受损后导致细胞失控性生长并丧失对机体组织调控的正常响应能力，受损细胞以快速节奏增殖和扩散形成不同程度的肿瘤。尽管存在多种治疗手段，但铂类药物尤其是顺铂和卡铂在过去四十年中主导了多种肿瘤的治疗格局。近年来，金属配合物引起了医学化学家的关注。席夫碱因其含有氮甲川基团而成为优异配体。四齿席夫碱N,N′-双(水杨醛基)-1,2-苯二胺（salophene）由两个酚羟基与两个亚胺部分组成。大量研究针对邻苯二胺衍生配体及其配合物开展了生物活性分析。Salen衍生物已成为抗癌药物研究的目标。近期研究强调了salophen型席夫碱金属配合物作为抗癌应用有前景候选物的潜力。四齿N₂O₂席夫碱配合物尤其受到关注，因为金属配位可显著影响其结构、电子和生物学性质。结合细胞毒性测定与分子对接的近期研究进一步证明了这些配合物在理解和改善抗癌活性方面的潜力。然而，尽管对salophen型金属配合物进行了广泛研究，针对同一卤代四齿席夫碱骨架配位不同金属中心的系统性比较，连同比较性细胞毒性及分子对接研究，仍然有限。

**研究内容与结论**

研究人员通过3,5-二溴水杨醛与邻苯二胺反应合成了salophen配体，并将该配体与铜、铂、钯、铁和镍氯化物反应制备了相应的金属配合物（CuL、PtL、PdL、FeL和NiL）。配体及其金属配合物在癌细胞系中进行了评估。通过DFT计算对PtL配合物的构型进行了优化。为深入理解优化后的PtL配合物与蛋白BCL-2（PDB ID: 6QGK）活性位点之间的非共价相互作用，开展了分子对接实验，该蛋白代表HepG2细胞系。研究结果表明，四溴代席夫碱配体与Ni(II)、Cu(II)、Fe(II)、Pt(II)和Pd(II)离子的配位可显著影响所得配合物的生物学性质。在所研究的化合物中，Pt(II)配合物对HepG2和A549细胞均表现出最显著的细胞毒性活性，表明金属配位和铂中心在调节席夫碱配合物生物学响应中的潜在作用。其他配合物尤其是Ni(II)和Fe(II)表现出相对较弱的细胞毒性活性。对接分析表明PtL的Br1原子可能通过与ALA207的常规氢键相互作用贡献于预测结合姿态的稳定性，而非共价相互作用网络似乎有助于对接模型中有利的蛋白–配体复合物缔合。分子对接分析表明PtL与蛋白6QGK之间具有有利的预测相互作用，相对结合能为?6.48 kcal/mol，抑制常数为17.85 μM。这些计算和实验发现提供了关于蛋白–配体相互作用的合理假设，并支持进一步实验研究以阐明观察到的生物学活性的分子基础。该研究的意义在于通过五金属比较研究结合生物学评价和分子对接，系统揭示了不同金属中心对同一卤代四齿席夫碱骨架配合物细胞毒性活性的影响，为后续抗癌金属配合物的理性设计提供了实验和计算依据。

**关键技术方法**

研究人员采用缩合反应合成席夫碱配体H₂L，通过回流法制备五种金属配合物，运用FT-IR、UV–Vis、NMR、质谱、元素分析、摩尔电导率和磁化率进行结构表征。采用MTT法评估化合物对HepG2、A549及L929细胞的细胞毒性并计算IC₅₀值和选择性指数。使用Gaussian 09在B3LYP/LANL2DZ水平进行DFT几何优化及前沿分子轨道和分子静电势分析。采用AutoDock4.2将DFT优化的PtL配合物与BCL-2蛋白（PDB ID: 6QGK）进行分子对接。细胞系来源为商业购买，未涉及特定样本队列。

**研究结果**

**配体与金属配合物的表征**：通过元素分析、NMR和FT-IR光谱、UV–vis分光光度法、质谱、摩尔电导率和磁化率分析对合成的金属配合物进行了综合表征。H₂L与相应金属盐反应获得的所有配合物均显示1:1的金属与配体化学计量比。摩尔电导率在2.01–3.58 μS/cm范围内表明配合物不具电解质导电性。H₂L的¹H NMR谱中约δ 14.07和δ 8.99 ppm处观察到分别归属于席夫碱酚羟基和氮甲川质子的明显单峰。配合物的¹H NMR谱中酚羟基O─H共振消失，与酚羟基去质子化及酚氧原子配位至金属中心一致。氮甲川质子化学位移的变化支持亚胺氮原子参与配位。FT-IR谱中C═N谱带从H₂L的1610 cm^?1移至配合物的1627–1595 cm^?1范围，表明C═N基团参与配合。547–532 cm^?1范围内新检测到的谱带归属于M─N伸缩振动，482–405 cm^?1区域的新谱带归属于M─O伸缩振动。UV–vis光谱中配合物在可见区（470–500 nm）出现新吸收带，归属于配体到金属或金属到配体的电荷转移过程；Pt(II)和Pd(II)配合物在575–705 nm范围内的谱带归属于d–d跃迁，支持配合物可能具有平面正方形或部分扭曲的平面正方形几何构型。FeL配合物在300 K下的有效磁矩为5.10 μ_eff，与高自旋Fe(II)（S = 2）构型一致。CuL的磁矩为2.18 BM，与铜中心平面正方形排列相容。镍、钯和铂配合物表现抗磁性，表明其电子构型中无未成对电子，基于这些磁性质及辅助光谱和分析发现，提出三种配合物均为平面正方形配位几何构型。所有物质的结晶研究均未成功获得单晶，因此无法进行单晶X射线分析。

**细胞毒性活性研究**：游离配体H₂L在HepG2细胞系中IC₅₀值为46.02 ± 3.67 μM，在A549细胞系中为33.53 ± 0.70 μM，表明配体尤其在A549肺癌细胞中表现出较高的细胞毒性效应。NiL配合物在HepG2和A549细胞中的IC₅₀值分别为125.70 ± 4.50 μM和250.30 ± 6.39 μM，表明镍配合物在两种细胞系中均表现出低细胞毒性活性，甚至低于游离配体。铂配合物PtL在两种细胞系中表现出最强的细胞毒性效应，HepG2细胞IC₅₀值为13.32 ± 1.24 μM，A549细胞为12.26 ± 1.52 μM，这些低IC₅₀值表明铂配合物具有非常高的细胞毒性活性，且比所有其他化合物更有效。PdL配合物在HepG2和A549细胞中的IC₅₀值分别为73.12 ± 5.26 μM和143.60 ± 6.91 μM，表明钯配合物具有中等细胞毒性效应但弱于铂配合物。FeL配合物在HepG2和A549细胞中的IC₅₀值分别为312.40 ± 7.49 μM和130.20 ± 4.73 μM，HepG2细胞中特别高的IC₅₀值表明该配合物具有低细胞毒性活性。CuL配合物在HepG2和A549细胞中的IC₅₀值分别为77.16 ± 3.58 μM和235.70 ± 7.29 μM，表明铜配合物在HepG2细胞中表现出中等细胞毒性效应，在A549细胞中细胞毒性效应较低。针对L929健康成纤维细胞系的IC₅₀值表明化合物对正常细胞普遍表现出低细胞毒性效应。H₂L（20.28 ± 2.57 μM）和PtL（24.54 ± 1.35 μM）对L929细胞表现出最高的细胞毒性效应。PdL（108.10 ± 3.23 μM）对健康成纤维细胞表现出低细胞毒性。FeL（330.90 ± 6.95 μM）、CuL（980.50 ± 6.86 μM）和NiL（1054.0 ± 5.40 μM）对健康成纤维细胞无活性。选择性指数评估显示，H₂L对HepG2和A549的SI值分别为0.44和0.60，低于1，表明对癌细胞无显著选择性。NiL对HepG2和A549的SI值分别为8.39和4.21，表现出高选择性。CuL表现出所有化合物中最显著的选择性，SI值分别为12.71（HepG2）和4.16（A549）。PtL表现出中等选择性，SI值分别为1.84和2.00。

**PtL的化学参数、前沿分子轨道和MEP分析**：通过DFT/B3LYP/LANL2DZ水平计算获得PtL的HOMO和LUMO能量值，并推导全局反应性参数。PtL表现出中等的HOMO–LUMO能隙（2.6476 eV），表明其具有平衡的稳定性和反应性。其电离势和电子亲和力值提示双重供体–受体行为，而相对较低的硬度和较高的软度突出了其对外部相互作用的响应性。较高的亲电性指数进一步证实了PtL稳定额外电荷的强烈倾向。前沿轨道分布显示HOMO主要定域于芳香环和供体原子上，表明可用于亲核相互作用的电子密度区域；LUMO表面集中于铂中心及相邻取代基周围，展示了亲电攻击的优选位点。HOMO和LUMO密度的空间分离连同MEP发现表明PtL表现出显著的亲电特征，同时保持足够的结构稳定性。MEP表面分析显示红色区域对应负电势区域主要定域于氧和氮供体原子周围，这些电负性位点可能作为氢键和亲电相互作用的优选区域；蓝色区域代表正电势区域主要围绕氢原子。铂原子本身表现出混合电势环境，反映其作为配位中心能够介导电子给予和接受的角色。MEP分析表明PtL的电子分布具有高度各向异性，具有可能影响其化学和生物学活性的独特反应位点。

**PtL对靶蛋白的分子对接研究**：生物学评价结果明确表明PtL配合物在所有合成化合物中表现出最强的细胞毒性活性。对接分析针对BCL-2（在HepG2细胞中过表达且对凋亡调控至关重要）进行，为观察到的抗增殖活性提供了可能的分子基础的计算见解。PtL的DFT优化几何构型为对接模拟提供了可靠的结构基础。对接结果表明PtL与蛋白6QGK活性位点有利相互作用。最适对接姿态的相对结合能为?6.48 kcal/mol，抑制常数为17.85 μM，表明在对接模型中形成稳定的结合姿态。分子对接分析揭示PtL与6QGK中氨基酸ALA206、ALA207和TYR202的催化位点发生相互作用。相互作用格局包括一个氢键、四个π–烷基接触、三个烷基相互作用和一个π–π T形接触，共同贡献于整体结合稳定性。PtL的Br1参与与ALA207的N原子形成常规氢键，常规氢键长度为3.3965 ?，从而增强配合物分子对接姿态的稳定性。PtL与BCL-2中ALA206、ALA207和TYR202残基的结合提示与蛋白的潜在相互作用，并为进一步研究其可能的生物学效应提供了基础。这些对接相互作用与实验观察到的强细胞毒性活性（HepG2中IC₅₀ = 13.32 μM，A549中12.26 μM）一致，表明计算发现与观察到的PtL生物学活性相符。阴性结合能反映稳定的配体–蛋白缔合，而微摩尔级Ki值与对接模型中潜在有利的蛋白–配体复合物相互作用一致。对接结果应被解释为关于潜在蛋白–配体或复合物相互作用的计算推导假设，而非确认导致观察到的抗癌活性的生物学机制。

**讨论与结论**

研究人员在讨论中指出，虽然PtL通过抑制BCL-2发挥抗癌活性的建议基于计算预测和BCL-2在HepG2细胞凋亡调控中的公认作用，但本研究未进行凋亡测定、活性氧测量或caspase激活研究来确认该机制。因此，对接结果应被解释为支持性证据而非生物学途径的确定性证明。对接结果提供了关于潜在蛋白–配体复合物相互作用的计算视角，并产生了可在未来机制研究中探索的假设。与先前报道的比较分析表明，Behzad等研究了过渡金属配合物对A549细胞的活性，报道了中等的对接评分和细胞毒性效应；另一项研究聚焦于靶向激酶的有机金属衍生物，产生了有利的对接结果并进行了部分生物学验证。相比之下，本研究引入了新合成的化合物，通过分子对接计算进一步研究，这些化合物对所选靶点表现出有利的预测结合能和相互作用特征，突出了研究方法的新颖性并强调了这些化合物用于治疗开发的潜力。研究结论部分指出：本研究表明四溴代席夫碱配体与Ni(II)、Cu(II)、Fe(II)、Pt(II)和Pd(II)离子的配位可显著影响所得配合物的生物学性质。在所研究的化合物中，Pt(II)配合物对HepG2和A549细胞均表现出最显著的细胞毒性活性，表明金属配位和铂中心在调节席夫碱配合物生物学响应中的潜在作用。其他配合物尤其是Ni(II)和Fe(II)表现出相对较弱的细胞毒性活性。对接分析表明PtL的Br1原子可能通过与ALA207的常规氢键相互作用贡献于预测结合姿态的稳定性，而非共价相互作用网络似乎有助于对接模型中有利的蛋白–配体复合物缔合。分子对接分析表明PtL与蛋白6QGK之间具有有利的预测相互作用，相对结合能为?6.48 kcal/mol，抑制常数为17.85 μM。这些计算和实验发现提供了关于蛋白–配体相互作用的合理假设，并支持进一步实验研究以阐明观察到的生物学活性的分子基础。