点击偶联载体的膜保留与细胞摄取

《Journal of Controlled Release》：Membrane retention and cellular uptake of click conjugated cargos

　　

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  开发了一种二苯并环辛炔（DBCO）功能化的聚丙烯酸（PAA）探针系统，该系统能够同时检测细胞的整体摄取和膜保留情况
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  低分子量载体的细胞 conjugation 效率较高，且膜保留时间更长
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  增加 DBCO 的密度可以提高细胞 conjugation 效率和膜保留时间
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  能量依赖的内吞作用和 caveolin 依赖的途径是共价结合载体的主要内吞途径

引言

真核细胞膜由半透性脂质双层组成，在决定哪些物质可以进入细胞方面具有高度选择性[1]、[2]、[3]。人们已经付出了大量努力来研究不同类型细胞的多种载体的摄取途径[4]、[5]。这些载体主要利用内在的摄取机制：扩散、跨膜通道和内吞作用[6]、[7]、[8]、[9]。前两种进入方式主要适用于较小的分子以及处于持续流动状态的物质，如离子和营养物质[9]、[10]、[11]。较大且复杂的载体通常通过网格蛋白（clathrin）、caveolae、吞噬作用或微吞作用（micropinocytosis）等方式进行内吞[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。这些途径共同决定了细胞如何导入外源性分子和颗粒，并且长期以来一直是各种药物递送策略的目标，旨在提高所关注载体的细胞摄取率或膜保留时间[17]、[18]。然而，共价结合到细胞膜上的分子是如何被细胞内化的，目前仍不清楚。

一种新兴的技术是将载体共价结合到细胞膜上，基于代谢糖标记和点击化学（click chemistry）[19]、[20]。对非天然糖进行代谢糖工程改造提供了一种简单而强大的方法，可以将独特的化学标签（例如叠氮基团）标记到细胞表面糖蛋白和糖脂上[21]、[22]。这种方法可以对各种类型的哺乳动物细胞进行化学标记，随后通过点击化学（如叠氮基团与二苯并环辛炔（DBCO）之间的反应）进行靶向结合，这种技术已广泛应用于多种成像和治疗应用[23]。据知，经过点击结合后，DBCO-载体最终会被细胞内化[24]、[25]、[26]、[27]。然而，共价结合的 DBCO-载体的膜保留时间（即它们在内化前停留在细胞膜上的时间）及其细胞摄取途径仍然不清楚（图 1a）。此外，调节 DBCO-载体的膜保留时间和细胞摄取率仍然是一个挑战。一方面，延长某些分子的膜保留时间对于操控细胞相互作用具有很大的潜力[28]、[29]、[30]、[31]。例如，在抗原呈递细胞上展示细胞因子可以持续刺激相互作用的 T 细胞，从而提高抗原特异性 T 细胞的活化效果[32]、[33]、[34]。另一方面，对于在细胞内起作用的药物来说，加快细胞的摄取速度更受欢迎[35]。

在这里，我们旨在系统地研究 DBCO-分子的膜保留和细胞摄取情况，使用 DBCO-功能化的聚丙烯酸（DBCO-PAA）作为模型系统，经过点击结合到叠氮标记的细胞上（图 1b）。选择 PAA 是因为它的细胞背景摄取率相对较低，分子量易于精确控制，并且易于进行化学修饰[36]、[37]、[38]。为了区分共价结合的 DBCO-PAA 和被动内吞的 DBCO-PAA，我们进一步用生物素（biotin）和 Cy5 对其进行了修饰。生物素可以在任何时间点检测细胞表面的 DBCO-PAA，而 Cy5 可以指示 DBCO-PAA 的整体细胞摄取情况。通过独立调节三个主要参数：分子量、DBCO 的密度和疏水性，我们研究了每个参数对点击结合效率、膜保留时间和细胞摄取率的影响。以 4T1 癌细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞为例，我们证明了 DBCO-载体的大小、电荷和疏水性共同决定了它们在共价结合到叠氮标记细胞后的膜保留时间和细胞摄取率。这一现象也适用于通过点击化学结合到细胞上的蛋白质。

章节片段

DBCO-PAA 作为检测膜保留和细胞摄取的模型系统

为了设计一种背景细胞摄取率极低且能够区分膜保留部分和内吞部分的分子探针，我们将带有负电荷羧基的 PAA 与 DBCO-胺修饰，然后与微量的生物素-叠氮酸和 Cy5-叠氮酸结合（图 2a）。使用了三种不同分子量的 PAA（分别为 2 kDa、50 kDa 和 450 kDa），并分别命名为 PAA_2k、PAA_50k 和 PAA_450k（图 S1）。DBCO、生物素等的密度

讨论

代谢糖标记结合点击化学已成为一种强大的工具，用于将各种类型的载体靶向细胞。然而，共价结合载体的膜保留和细胞摄取机制仍然不甚明了。这与通过细胞膜分子与细胞外载体之间的静电或疏水相互作用发生的自然内吞过程不同。因此，了解共价结合的载体是如何被细胞内化的仍然是一个未解之谜

方法

材料与仪器。D-甘露胺盐酸盐、DBCO-Cy5、聚丙烯酸 2 kDa、50 kDa 和 450 kDa、叠氮化钠、醋酸酐及其他化学试剂均购自 Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。DBCO-Cy5 和 DBCO-sulfo-胺购自 Vector Lab（美国加利福尼亚州纽瓦克）。eFlour 780 可固定活性染料（65–0865-14）、anti-APC 生物素、anti-PE 生物素、FITC-avidin、AF647-avidin 由 Thermo Fisher 提供

CRediT 作者贡献声明

Dhyanesh Baskaran：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，方法论，研究，数据分析，概念化。Yang Bo：方法论，研究，数据分析，概念化。Mehak Batra：研究。Akarsh Ellore：研究。Yusheng Liu：方法论，研究。Hua Wang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，监督，项目管理，方法论，资金获取，数据分析，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢以下机构的 financiational 支持：NSF DMR（H.W.），NIH（R01CA274738（H.W.），NIH（R21CA270872（H.W.），Sontag 基金会杰出科学家奖（H.W.），以及 美国癌症协会研究学者资助（RSG-24-1318096-01-RMC（H.W.）。

Dhyanesh Baskaran|Yang Bo|Mehak Batra|Akarsh Ellore|Yusheng Liu|Xin Wang|Hua Wang