《Journal of Controlled Release》：Macrophage-targeted GAS6 siRNA delivery by a multifunctional mannan-peptide nanocarrier attenuates pulmonary fibrosis progression
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•MR3是一种含有甘露聚糖和R3H7C肽的复合物，可用于安全、高效地递送siRNA。•MR3能够通过CLR介导的途径选择性地将siRNA递送到肺泡巨噬细胞中。•MR3不仅具有强大的基因沉默能力，还具备天然的抗氧化活性。•siGAS6@MR3能够抑制GAS6信号通路，从而防止肺纤维
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MR3是一种含有甘露聚糖和R3H7C肽的复合物，可用于安全、高效地递送siRNA。
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MR3能够通过CLR介导的途径选择性地将siRNA递送到肺泡巨噬细胞中。
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MR3不仅具有强大的基因沉默能力，还具备天然的抗氧化活性。
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siGAS6@MR3能够抑制GAS6信号通路，从而防止肺纤维化的进展。
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siGAS6@MR3在重复给药时表现出良好的安全性。
引言
特发性肺纤维化（IPF）是一种原因不明的慢性进行性间质性肺疾病，其特征是胶原沉积过多和肺功能不可逆地下降[1],[2]。IPF的主要死亡原因是慢性低氧性呼吸衰竭，预后较差，诊断后的中位生存期为3至5年[3],[4]。据估计，全球约有300万人受到这种严重疾病的困扰[5]。值得注意的是，在COVID-19大流行期间，肺纤维化已成为一个重要的并发症，多项临床研究表明它与严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）感染有密切关联[6],[7],[8]。目前，监管机构已经批准了三种药物（吡非尼酮、尼达尼布和奈达米星）用于治疗IPF[9],[10],[11]。虽然这些药物可以减缓疾病进展，但无法逆转已形成的纤维化，并可能产生不良副作用[12],[13],[14]。因此，迫切需要阐明IPF的发病机制，并寻找新的药物靶点，以推动更有效、能够改变疾病进程的疗法的开发。
尽管IPF的发病机制尚未完全明确，但越来越多的证据表明肺泡巨噬细胞在IPF中起着关键调控作用[7],[15],[16],[18]。作为肺部先天免疫系统的核心效应细胞，巨噬细胞具有显著的适应性，可以根据微环境和外部刺激分化为不同的功能表型[19]。在损伤的早期阶段，经典激活的M1型巨噬细胞通过产生促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1（IL-1）以及活性氧（ROS）[20],[21],[22]，导致肺泡上皮细胞损伤和炎症反应的启动。随着疾病的发展，巨噬细胞逐渐向另类激活的M2型表型转变，分泌促进成纤维细胞活化、增殖和细胞外基质（ECM）过度沉积的细胞因子（如转化生长因子-β（TGF-β）[23],[24],[25]，从而推动纤维化重塑。因此，调节巨噬细胞的极化或针对相关信号通路成为治疗IPF的一种有前景的策略。
生长停滞特异性蛋白6（GAS6）是一种依赖维生素K的TAM受体酪氨酸激酶（Tyro3/Axl/MerTK）的配体[26],[27]。在肺纤维化中，活化的巨噬细胞表达高水平的GAS6，GAS6-TAM信号通路促进M2型巨噬细胞的极化以及成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，进而导致胶原沉积和肺组织重塑[28],[29],[30],[31]。虽然通过抗体或小分子激酶抑制剂在受体水平上抑制这一通路可以减轻纤维化[32],[33]，但TAM受体酪氨酸激酶也参与内皮细胞存活、自然杀伤细胞发育、肝细胞再生、促性腺激素释放激素神经元的存活、血小板激活和血栓形成调节[34]。因此，全身给药RTK抑制剂存在广泛的脱靶毒性风险。我们假设选择性地在局部沉默配体GAS6，而不是全身抑制这些共享受体，可以实现抗纤维化效果，并显著提高安全性，因为这样可以阻断疾病微环境中的病理信号通路，同时保持其他组织中TAM受体的正常功能。
自从FDA批准了基于siRNA的首个治疗方法Patisiran以来，siRNA技术已经从基础研究工具发展成为具有临床应用价值的平台[35],[36]。然而，siRNA疗法的临床成功在很大程度上取决于高效且具有靶向性的递送系统[37]。由于病毒载体的高效转导能力，它们仍然被广泛使用，但安全性和免疫原性问题促使人们努力改进载体设计[38],[39],[40]。非病毒递送系统因具有良好的安全性、低免疫原性和可制造性而成为研究的热点[41],[42]。尽管取得了显著进展，但许多现有平台仍无法精确地靶向特定的细胞群，这严重限制了核酸治疗药物在病变部位的有效积累和功能递送。
为了克服这些关键限制，程的研究团队引入了一种基于肽-多糖的核酸递送平台[43],[44],[45],[46]。在这里，研究了一种比以往方法更具生物相容性的甘露聚糖-肽递送系统（MR3），用于将siRNA靶向递送到纤维化肺组织中的巨噬细胞。MR3支架结合了能够与巨噬细胞表面的C型凝集素受体结合的甘露聚糖骨架，以及一种富含精氨酸和组氨酸的肽，这种肽能够浓缩siRNA并促进其进入内体，从而实现受体的协同识别、高效内吞和胞质释放。利用这一平台，我们在肺泡巨噬细胞中实现了对GAS6的靶向沉默，并在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中评估了其治疗效果。值得注意的是，该设计利用了甘露聚糖和氨基酸的天然抗氧化特性，从而保护细胞免受ROS的损伤。转录组分析进一步揭示了siGAS6@MR3的抗纤维化机制。总的来说，这些发现表明GAS6是一个安全有效的靶点，可用于抑制纤维化进展，并突显了MR3作为一种多功能、针对巨噬细胞的siRNA递送工具，在纤维化疾病中具有广泛的应用潜力。
章节摘录
siRNA@MR3的制备和物理化学表征
该递送系统基于我们之前的研究进行了优化，避免了使用乙烯基砜进行载体构建[45]。为了构建高效的siRNA递送载体，通过两步策略（亲核加成和光诱导自由基加成）将阳离子肽R3H7C与甘露聚糖偶联，得到名为MR3的多糖-肽复合物（图1A）。使用1H NMR对其进行分析，发现取代度约为20%
讨论
IPF仍然是一种致命的疾病，可用的治疗选择有限。目前，监管机构已经批准了三种药物（吡非尼酮、尼达尼布和奈达米星）用于治疗IPF[9],[10],[11]。然而，这些药物只能减缓疾病进展，并伴随显著的副作用，这凸显了开发更有效、更安全的干预措施的紧迫性[12],[13],[14]。尽管巨噬细胞是纤维化重塑的关键驱动因素，但针对它们的治疗手段仍然
材料
该肽（纯度>98%）由GenScript Biotech Co., Ltd.（中国南京）定制合成。甘露聚糖、脂多糖（LPS）和离心过滤器（30K）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。1,8-二氮杂环[5.4.0]十一烯（DBU）、烯丙基异氰酸酯（AI）和D-甘露糖购自Adamas-beta（中国上海）。透析袋（分子量截留范围2000 Da和10,000 Da）购自上海豫研生物科技有限公司（中国上海）。二甲基亚砜（DMSO）
CRediT作者贡献声明
施双妮：撰写——初稿、可视化、验证、软件开发、项目管理、方法学设计、实验设计、数据整理。徐亮波：验证、方法学设计。秦芦曼：撰写——审稿与编辑。肖涵：验证。张毅伟：验证。高东东：验证。张世荣：撰写——审稿与编辑。王淑英：撰写——审稿与编辑。陈玉忠：验证。林雷毅：验证。刘向生：撰写——审稿与编辑。宋海清：撰写——
资助
本工作得到了中国国家自然科学基金会（资助编号52473149和52203336）和西湖大学（创业基金及资助编号WU2025MY007）的支持。
致谢
我们感谢西湖大学分子科学仪器服务中心、物理科学仪器服务中心、生物医学研究核心设施和实验动物资源中心在实验测量方面提供的帮助。
施双妮|徐亮波|秦芦曼|肖涵|张毅伟|高东东|张世荣|王淑英|陈玉忠|林雷毅|刘向生|宋海清|程刚
