《Journal of Controlled Release》：Reprogramming endocytic trafficking of antibody–drug conjugates to enhance tumor penetration and lysosomal delivery
编辑推荐：
•通过转运信号肽可以重新编程ADC的内吞途径。•融合肽能够增强ADC的内吞作用，并将其从回收途径重新导向溶酶体。•分子动力学验证了肽在抗体上的稳定展示。•具有信号融合功能的ADC对HER2低表达肿瘤细胞仍具有显著的细胞毒性。•患者来源的类器官和异种移植模型证实了肿瘤的持久消退。引
- •
通过转运信号肽可以重新编程ADC的内吞途径。
- •
融合肽能够增强ADC的内吞作用，并将其从回收途径重新导向溶酶体。
- •
分子动力学验证了肽在抗体上的稳定展示。
- •
具有信号融合功能的ADC对HER2低表达肿瘤细胞仍具有显著的细胞毒性。
- •
患者来源的类器官和异种移植模型证实了肿瘤的持久消退。
引言
尽管抗体-药物偶联物（ADCs）已经彻底改变了癌症治疗[1]、[2]、[3]、[4]，但其临床疗效仍受到内吞作用和细胞内转运机制的限制。大多数肿瘤相关抗原的内吞动力学不佳，或无法有效递送到降解途径，从而形成了三大主要障碍：(i) 由于抗原密度低或内吞动力学缓慢导致抗体内吞受限[5]、[6]、[7]；(ii) 被内吞的复合物滞留在早期或分选内体中，未能进入溶酶体[8]、[9]、[10]；(iii) “回收陷阱”，即受体通过Rab11依赖性途径迅速被回收至质膜，导致药物无法通过蛋白水解途径释放，从而增加药物的外排[11]、[12]、[13]。
人表皮生长因子受体2（HER2）是乳腺癌、胃癌等多种癌症的致癌驱动因子[14]、[15]、[16]、[17]、[18]，它正是这种“回收陷阱”的典型例子。尽管HER2会发生持续的内吞作用，但其强烈的回收特性阻碍了受体被递送到溶酶体进行降解，从而降低了ADC的疗效并缩短了治疗窗口[4]、[19]、[20]、[21]、[22]。这些相互关联的障碍共同限制了细胞内药物的积累，尤其是在抗原表达不均匀的肿瘤以及目标抗原表达水平较低的细胞中[23]、[24]、[25]。
虽然双位点和双特异性策略改善了ADC的内吞效果，但它们仍然受到受体天然转运机制的被动限制[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。这些抗体同时针对同一抗原上的两个不同抗原或非重叠 epitope，从而促进受体聚集并促进ADC-抗原复合物进入溶酶体。例如，四价抗HER2抗体能够将受体交联成网格状复合物，增强聚集诱导的内吞作用，并部分抑制Rab11介导的回收。然而，当抗原密度低于形成网格所需的阈值时，其疗效会显著下降[34]、[35]、[36]。同样，尽管可回收的内体可以处理可切割的连接子（在Rab11阳性区域释放高达35%的药物载荷[13]），以及降解剂-药物偶联物可以利用内吞受体（如LDLR）作为“特洛伊木马”，但这些策略仍受限于特定受体的转运途径[37]。重要的是，这些方法并没有从根本上改变内吞过程；它们只是利用现有的途径，而没有主动参与细胞的分选机制，包括调节转运内体中货物命运的适配蛋白（AP）复合体和Rab GTP酶效应器。因此，这些复合物仍然容易受到Rab11依赖性的回收和药物外排的影响。对于ADC而言，关键不是受体的消除，而是有效的细胞内药物暴露。只有当ADC-抗原复合物以与连接子切割和药物释放相匹配的速度到达降解途径时，内吞过程才是有效的；相反，Rab11介导的回收会将未切割的ADC重新送回细胞表面，缩短溶酶体中的停留时间，从而影响蛋白酶介导的药物释放。因此，仅增加抗原密度、价态或促进聚集并不能解决药物释放缓慢、ADC耐药性或旁观者杀伤效应减弱的问题。因此，亟需一种能够主动将内吞复合物从回收内体重定向到降解溶酶体的策略，这种方法不依赖于内源性受体的转运机制，而是通过物理方式将药物载荷与内源性溶酶体分选机制相连。
我们之前建立了一个名为“信号介导的溶酶体导向嵌合体（SignalTACs）”的化学生物学平台，证明合成转运信号可以劫持内源性内吞机制，从而克服自然的分选信号[38]、[39]。在这些研究中，P1/P3衍生的信号（包括后来用于生成P2/P3的分选和内吞基序）主要被用于靶向蛋白质降解：溶酶体作为最终目标，治疗终点是细胞表面目标的消失。本研究采用相同的模块化转运元素来解决不同的药物递送问题。对于ADC来说，溶酶体递送并不是最终目标；它是决定药物载荷释放动力学、细胞内保留时间、旁观者杀伤效应以及最终治疗效果和安全性的关键因素。因此，我们重新使用了P2/P3，因为它们提供了明确的分选指令，可以安装在经过验证的抗体骨架上，以测试内吞途径的重定向是否能够将易于回收的目标转化为高效的ADC递送途径。
在这里，我们将“转运工程”定义为一种药物递送策略，而不仅仅是一种降解策略。我们使用P2/P3作为模块化定向元件，并引入MMAF/MMAE载荷的位点特异性接合，以研究ADC的一个关键变量：有效的溶酶体内药物暴露。我们认为，将P2/P3与曲妥珠单抗融合可以激活细胞内的内吞和分选机制，减少内吞的ADC-HER2复合物的Rab11依赖性回收，并加速其从Rab5阳性早期内体向Rab7和LAMP1阳性降解途径的转运。这种重编程使得在HER2高表达、中等表达和低表达的肿瘤模型中都能实现皮摩尔级别的细胞毒性，并诱发强烈的旁观者杀伤效应。此外，尽管T1/T2衍生的ADC的药代动力学特性与原始曲妥珠单抗（Tz）相似，但它们在异质性患者来源的类器官（PDOs）和异种移植（PDXs）中显示出更高的肿瘤内积累，并能诱导乳腺癌、胃癌和膀胱癌的完全、持久消退。总之，我们的发现证明了通过直接操纵细胞分选机制来合理设计内吞途径是一种通用的策略，可以克服内在的回收障碍，拓展下一代ADC的治疗潜力。这一概念上的进步在于证明了先进的分选指令可以通过将内吞途径转化为可控的药物递送参数来主导ADC的药理学效应。
章节片段
溶酶体导向ADC的开发：设计、制备和结合亲和力
我们研究了两种基于之前报道的信号肽的溶酶体导向ADC平台：溶酶体分选肽（P1：SFHDDSDEDLLHI）[38]和内吞信号肽（P3：SYKYSKVNKE）[39]，这两种肽都来自CI-M6PR。我们进一步通过将细胞穿透肽（RRLRK）与P1结合来生成肽P2，以增强细胞内内吞作用。最初，P2和P3被基因融合到抗HER2单克隆抗体的轻链和重链的C端。
讨论
ADCs极大地改变了靶向癌症治疗；然而，它们的疗效仍受到抗原异质性、内吞效率低下以及“回收陷阱”的限制，这些因素都限制了溶酶体内药物载荷的递送。在这项研究中，我们提出了“转运工程”作为ADC设计的范式转变，证明了将转运信号与抗体基因融合可以根本性地重新编程内吞途径。通过利用细胞自身的分选机制
实验部分
细胞培养：人类癌细胞系SKOV-3（RRID:CVCL_0532）、NCI-N87（RRID:CVCL_1603）、JIMT-1（RRID:CVCL_2077）、5637（RRID:CVCL_0126）、T24（RRID:CVCL_0554）和MDA-MB-231（RRID:CVCL_0062）均来自美国类型培养集（USA）。SKOV-3、NCI-N87、5637和T24细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Procell）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养。MDA-MB-231细胞则在含有10% FBS和1%
CRediT作者贡献声明
马一轩：撰写 – 审稿与编辑，实验研究。邓新培：撰写 – 初稿，实验研究。黄文军：撰写 – 审稿与编辑，实验研究，数据管理。李娜：撰写 – 初稿，方法学研究，实验研究，形式分析。钟一林：实验研究。周素斌：实验研究。马静：实验研究。梁玉婵：实验研究。孙环环：实验研究。张一树：实验研究。郑振婷：实验研究。司一鸣：方法学研究。周强华：
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（编号：82473828、82173723，资助对象为X.C.和K.Y.）、广东省基础与应用基础研究基金（编号：2024A1515010432、2024A1515013007，资助对象为X.C.和K.Y.）以及中山大学“3510”医疗创新领导计划（编号：20263510YXQN017，资助对象为X.C.）的支持。我们还要感谢仪器部的陈建文先生和梁莫女士的帮助
马一轩|邓新培|黄文军|李娜|钟一林|周素斌|马静|梁玉婵|孙环环|张一树|郑振婷|司一鸣|周强华|翟莉|蔡晓青
