基于铁配位聚氨基酸纳米探针的磁共振血管成像：一项体外与体内实验研究

《European Radiology Experimental》：Magnetic resonance angiography based on iron-coordinated poly(amino acid)s nanoprobes: an in vitro and in vivo experimental study

　　

目的：开发一种基于Fe(III)-聚(氨基酸)s配位复合物（Fe@polyDOPA-b-polysarcosine，Fe@POS）的无钆T1加权磁共振（MR）对比纳米探针，用于具有延长成像窗口的高分辨率MR血管成像（MRA）。材料与方法：Fe@POS纳米探针通过Fe(III)与聚DOPA-b-聚肌氨酸共聚物的自组装制备。进行物理化学和细胞学表征以证明其用于MRA的可行性。在新西兰兔上进行主动脉MRA，分为接受Fe@POS纳米探针的实验组（n = 3）和接受钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）的对照组（n = 3）。在巴马小型猪（n = 3）上进行心脏和肝脏MR采集。在BALB/c小鼠上进行长期生物分布（n = 3）和生物安全性（n = 4）评估。在BALB/c小鼠（n = 5）和巴马小型猪（n = 3）上进行短期和急性毒性评估。结果：Fe@POS纳米探针呈现规则的纳米胶束结构，平均粒径为25 nm。与Gd-DTPA（r1 = 4.38 mM^-1 s^-1）相比，Fe@POS纳米探针表现出更高的纵向弛豫率（r1 = 5.74 mM^-1 s^-1）。在兔模型中，注射Fe@POS后腹主动脉MR信号增强超过4 h。在猪模型中，心血管系统MRA观察到延长的T1增强，MR图像显示详细的动脉和静脉血管系统。生物安全性评估表明，Fe@POS纳米探针在测试条件下表现出令人满意的生物相容性，主要器官中无长期铁蓄积。结论：Fe@POS纳米探针可同时提供心血管系统的高分辨率T1加权MRA，具有延长的成像窗口。

心血管疾病已成为全球范围内主要的公共卫生问题及首要致死原因。血管腔及病理学改变通常发生于心血管疾病的发病过程中，可通过高分辨率血管成像技术进行检测和鉴别。临床实践中，数字减影血管造影（DSA）被视为血管疾病评估的金标准，但DSA属于有创介入方法，存在相关并发症风险。计算机断层扫描血管成像（CTA）可提供异常结构的详细图像及血管生理信息，然而CTA产生的电离辐射引发担忧，尤其是对儿科和孕妇等脆弱人群。动态对比增强磁共振血管成像（MRA）因其高空间分辨率、不受限的组织穿透性、无创性及无电离辐射等优势，已成为诊断心血管疾病不可或缺的成像技术。钆基对比剂（GBCAs）在T1加权MR对比剂的医学应用中占主导地位。然而，静脉注射的小分子GBCAs可迅速从毛细血管外渗至组织间隙，导致体内血液循环时间短、成像窗口不足。此外，GBCAs与肾功能不全患者的肾源性系统性纤维化相关，并可在脑组织中沉积。这些局限性促使研究人员探索更具生物相容性和有效性的GBCAs替代方案。

研究人员已开发基于Fe(III)的MR对比剂用于多模态MRA。Fe(III)作为必需微量元素，与Gd(III)相比具有更优的生物安全性。然而，缺乏内界水交换位点的小分子Fe(III)配位复合物表现出较低的纵向弛豫率，与Gd(III)配位复合物类似。Fe(III)掺杂纳米颗粒具有更长的翻滚时间（τR），因此较小分子Fe(III)复合物提高了纵向弛豫率。这种显著增强归因于Fe(III)在纳米颗粒中的几何限域效应。Ferumoxytol是一种非肾毒性的超小氧化铁制剂，已获美国食品药品监督管理局批准用于治疗缺铁性贫血。该制剂甚至可对晚期肾病患者无创地可视化急性心肌梗死和主动脉疾病。此外，Fe(III)掺杂纳米颗粒的血液循环时间可通过适当的亲水性表面修饰予以延长，有助于长期MR心血管造影。

聚(α-氨基酸)s是由α-氨基酸通过肽键连接构建的生物相容性和可生物降解聚合物。聚(α-氨基酸)s的仿蛋白结构和性质推动了其在生物医学领域的广泛应用，包括刺激响应性生物材料、控释药物和基因递送、组织工程及生物医学成像。聚肌氨酸是聚肽家族的一员，具有高水溶性、低细胞毒性、抗蛋白吸附和无免疫原性等特点。

本研究旨在开发一种无钆T1加权对比剂，用于心血管系统的高分辨率和长期MRA。研究人员报道了通过Fe(III)与聚DOPA-b-聚肌氨酸二嵌段共聚物自组装制备Fe(III)-聚合物配位纳米探针（Fe@POS），旨在实现具有长时间窗口的精准MRA。此外，研究人员评估了Fe@POS纳米探针的体内生物相容性，以阐明其潜在临床应用价值。

本研究在浙江大学医学院附属邵逸夫医院伦理委员会的监督和指导下进行。MRI实验在3-T MR扫描仪上完成。动物实验遵循当地动物福利委员会规定的实验动物护理和使用方案和标准（中国杭州；批准号：SRRSH202310001）。所有动物实验均在认证实验动物兽医（Y.Y.）的指导和监督下进行。本研究纳入BALB/c小鼠（长期生物分布n = 3，生物安全性评估n = 4）、新西兰兔（n = 6；Fe@POS组n = 3；Gd-DTPA对照组n = 3）和巴马小型猪（n = 3）。Fe@POS纳米探针通过Fe(III)与聚DOPA-b-聚肌氨酸二嵌段共聚物（PDOPA-b-PSar，缩写为POS）自组装合成。Fe(III)浓度通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测量。动态光散射（DLS）测量使用粒径分析仪完成。透射电子显微镜（TEM）测量使用JEM-1400plus电子显微镜完成。小鼠来源结肠癌细胞（CT26）和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）用于细胞培养。细胞毒性在NIH 3T3细胞中使用Cell Counting Kit-8 assay评估。Fe@POS的细胞摄取在CT26细胞中使用FITC标记的Fe@POS通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估。磁共振扫描在3-T MR扫描仪上完成。纵向弛豫率r1通过反转恢复脉冲序列获得。新西兰兔体内MRI使用3-T临床人体MR系统和腹部线圈模拟患者扫描条件。巴马小型猪体内MRA在3-T扫描仪上完成。生物分布分析中，雌性BALB/c小鼠随机分为五个实验组和一个对照组，通过ICP-MS定量主要器官的Fe浓度。为评估Fe@POS的生物安全性，进行长期体重监测，并分析血清生化和血液学指标。数据以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism V8.0分析。

Fe@POS纳米探针呈现球形，均匀直径约25 nm，具有精细的胶束结构。动态光散射分析表明Fe@POS的平均流体动力学尺寸为20.4 nm，多分散性指数（PDI）窄至0.208，与透射电子显微镜结果一致。Fe@POS纳米探针在磷酸盐缓冲液（PBS）和含内源性阳离子的盐水中表现出长期稳定性，制备后10天内流体动力学尺寸和纵向弛豫率无显著变化。为验证Fe@POS在生理条件下的稳定性，将BALB/c小鼠血清与Fe@POS在37 °C共孵育48 h，结果显示纳米探针的粒径和弛豫率无显著变化。Fe@POS的释放曲线表明，合成后48 h内纳米颗粒内部Fe(III)离子的累积释放低于5%。体外T1加权MRI显示T1信号强度随Fe浓度增加而增加。Fe@POS和Gd-DTPA的纵向弛豫率r1在20 °C、3.0 T磁场强度、去离子水中测量。结果显示Fe@POS的r1值为5.74 mM^-1·s^-1，比Gd-DTPA（4.38 mM^-1·s^-1）高1.3倍。在10 μg/mL至1,000 μg/mL浓度范围内孵育24 h后，POS和Fe@POS均未观察到统计学显著的细胞毒性。流式细胞术分析FITC标记Fe@POS的细胞摄取，孵育时间从2 h延长至6 h使CT26细胞摄取率从74.80%增至99.54%，表明CT26细胞在较短时间内快速吸收FITC-Fe@POS。共聚焦显微镜荧光成像显示FITC-Fe@POS的亚细胞分布，绿色FITC荧光见于细胞质，与溶酶体红色荧光重叠，提示Fe@POS纳米探针的细胞摄取主要由内溶酶体途径介导。

在兔模型的血池MRA中，对Fe@POS与Gd-DTPA的对比增强动力学进行比较分析。定量评估显示Fe@POS在主动脉增强幅度和持续时间方面均优于Gd-DTPA。注射后1 min，Fe@POS组主动脉对比噪声比（CNR）显著高于Gd-DTPA组（Fe@POS组18.8 ± 2.5 vs Gd-DTPA组13.1 ± 1.6，p = 0.039）。Gd-DTPA组主动脉CNR在注射后4 min内恢复至基线水平，而Fe@POS组在给药后4 h内维持显著升高的主动脉CNR。Fe@POS组表现出明显较Gd-DTPA组更慢的信号衰减动力学。从3 min时间点（Fe@POS 88.1 ± 11.6% vs Gd-DTPA 43.5 ± 6.6%，p = 0.008）至240 min时间点（Fe@POS 53.7 ± 9.0% vs Gd-DTPA 1.6 ± 3.7%，p < 0.001），Fe@POS组主动脉信号保留率更高。此外，Fe@POS组兔肾CNR在注射后5 min内从0.54 ± 0.04增至4.22 ± 0.47（p = 0.005），并维持升高超过5 h；Gd-DTPA对照组肾CNR在注射后1 min达峰值（0.27 ± 0.05至2.47 ± 0.80，p = 0.031），随后逐渐下降并在3 h内恢复至基线。在巴马小型猪模型中进行MRA，静脉注射后Fe@POS纳米探针经血流循环至心脏，经主动脉泵出，同步增强心脏、动脉和静脉。猪上身显示高空间分辨率的血管系统，有助于识别不同级别的复杂血管。心脏主要动脉包括主动脉、颈动脉及其分支、锁骨下动脉及其分支和椎动脉；回流至心脏的主要静脉包括上腔静脉和下肺静脉。注射Fe@POS后2 h内可视化脑静脉窦，包括横窦、上矢状窦、下矢状窦和大脑上静脉。Fe@POS纳米探针实现延长的心脏和肝脏T1加权MRI。心脏MRI分析显示Fe@POS给药后胸主动脉信号显著增强，持续对比维持超过3 h。定量评估显示主动脉CNR在1 min内从0.5 ± 0.2显著升高至峰值44.5 ± 3.9（p < 0.001），3 h后主动脉CNR仍显著高于注射前（28.7 ± 2.8，p < 0.001）。肝静脉增强在注射后3 min开始，持续超过60 min，肝静脉CNR从8.9 ± 1.6显著增至峰值47.8 ± 7.4（p = 0.003），1 h时逐渐下降至23.5 ± 8.9（与注射前相比p = 0.047）。

为系统评估Fe@POS纳米探针的体内行为，在BALB/c小鼠中进行生物分布分析。定量ICP-MS显示注射后24 h内Fe@POS优先蓄积于心脏、肝脏和肾脏组织。48 h时所有检查器官（心、肺、肝、脾、肾）的铁浓度与对照组相比无显著差异，表明Fe@POS不引起主要器官的长期铁蓄积。研究人员还建立高剂量组（三倍标准剂量）以研究过量给药是否诱导全身毒性。标准剂量和高剂量组在14天观察期内平均体重波动可忽略，与健康小鼠相比无统计学显著差异，表明无全身毒性。血清生化分析显示，7天或14天后所有肝功能参数（丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST、碱性磷酸酶ALP、白蛋白ALB、球蛋白GLB、总蛋白TP）和肾功能参数（肌酐CR、尿酸UA、血尿素氮BUN）均在生理参考范围内，证明无Fe@POS诱导的肝毒性和肾毒性。在啮齿类和猪模型中通过血液学分析进一步验证Fe@POS的生物安全性。小鼠长期重复给药研究中，第7天或第14天血液学参数与对照组相比无显著差异。短期和急性毒性研究中，小鼠注射后24 h及猪注射后24 h和48 h均未检测到血液学参数显著变化。所有累积证据表明Fe@POS纳米探针具有优异的生物安全性。

讨论部分：GBCAs较短的体内血液循环时间（< 30 min）是应用于MRA时的临床局限性，限制了血管成像的时间窗口。其他担忧包括肾功能不全患者肾源性系统性纤维化风险及钆的长期组织沉积。这促使开发具有高生物安全性和长血管滞留时间的新型磁共振对比剂。本研究设计并制备了基于两亲性聚DOPA-b-聚肌氨酸二嵌段共聚物的自组装纳米胶束（Fe³⁺@PDOPA-b-PSar，Fe@POS），表现出高纵向弛豫率（r1 = 5.74 mM^-1 s^-1，20 °C，3.0-T磁场，去离子水中）。需注意r1值在体内生理条件下可能不同。在动物模型中，Fe@POS纳米探针在血管系统中滞留超过3 h，实现高空间分辨率MRA。Gd-DTPA给药后动态增强MR的特征常被描述为"快进快出"。临床实践中，对比增强MRA需要精确的团注定时以使采集与动脉峰值增强同步。早期成像可导致振铃伪影和信号强度降低；晚期成像因静脉和软组织增强导致信号强度降低。然而，长窗口期成像在临床实践中至关重要，因为多种心脑血管疾病涉及全身多器官，如动脉粥样硬化和动脉瘤。本研究中MRI结果表明Fe@POS纳米探针在兔模型中的血流滞留时间为4 h，在猪模型中> 3 h，超过Gd-DTPA。此外，动态增强MRA中难以区分复杂血管系统，尤其是非垂直于扫描方向的微血管。本研究中Fe@POS给药后猪模型3D MRA重建显示清晰的动脉和静脉系统形态，这一改善归因于Fe@POS纳米探针的延长血管滞留和高MR敏感性。因此，Fe@POS纳米探针较临床GBCAs提供更优的诊断精度，可同时准确成像动脉和静脉。随着纳米技术的发展，临床医生已利用生物医学分子纳米探针精确成像血管并可视化病变及周围组织的病理过程。除GBCAs外，ferumoxytol作为一种基于超顺磁性氧化铁（SPIO）的制剂，已被报道作为MRA的T1加权对比剂。Ferumoxytol和Fe@POS均为基于Fe(III)的纳米颗粒，但其体内分布和成像模式显著不同。Ferumoxytol表现出双T1和T2效应，在高浓度时显著衰减T1信号，因此在首过窗口期可在腹主动脉观察到模拟血管血栓形成的磁化率伪影。与ferumoxytol不同，Fe@POS纳米探针的MRI增强能力完全来源于纳米胶束核心密集簇集的顺磁性Fe(III)离子。Fe@POS独特的纳米结构缺乏引起T2 MR增强的晶格和超顺磁性，在较高浓度下仍具有稳健的T1 MR增强效应，这是相较于ferumoxytol的优势。此外，这些纳米级SPIO纳米颗粒面临的未解决临床挑战之一是其诱导超敏反应的潜力。研究表明SPIO基纳米颗粒进入人体后可激活补体系统，从而触发补体激活相关假性过敏。这些超敏反应包括呼吸困难、发热、皮疹和心悸，已导致大多数商用SPIO基对比剂撤市（ferumoxide/Endorem?、ferumoxytol/Feraheme?）。Fe@POS在化学上不同于SPIO基纳米颗粒。Fe@POS采用聚肌氨酸壳层——一种高度亲水性聚肽，已知可抵抗非特异性蛋白吸附并抑制补体激活。该涂层与早期SPIO基制剂中使用的碳水化合物或合成聚合物涂层形成鲜明对比，后者与补体激活相关假性过敏有关。与这一设计一致，研究人员在小鼠和猪中的生物安全性评估未发现急性不良反应。因此，研究人员假设Fe@POS可能不会引发与SPIO基对比剂相同的超敏反应，因为Fe@POS的聚肌氨酸壳层可防止补体激活。在临床MRI应用中，常规低分子量GBCAs受限于快速全身清除，需要使用快速扫描序列在GBCAs首次通过血管时捕获图像。本研究中Fe@POS的延长血流滞留使得能够实施延长扫描序列，为成像复杂和小血管提供显著优势。本研究处于临床前试验阶段。为促进Fe@POS作为MRA对比剂的临床转化，未来工作将聚焦于全面数据收集，包括长期体内成像性能的多模型评估。本研究存在若干局限性。首先，虽然研究人员已在动物模型中证明Fe@POS纳米探针的可行性和成像效力，但最佳剂量尚未研究。MRA的适当剂量可能因每种动物物种的体重、代谢率和血流动力学特征而有很大差异。建立大型动物模型中剂量与成像效力的关系对Fe@POS纳米探针的临床转化至关重要。其次，本研究未评估血管内皮细胞对Fe@POS纳米探针的潜在吞噬作用。循环纳米颗粒的内皮内化可能显著影响其血管内滞留时间和成像动力学。鉴于延长血管滞留是Fe@POS纳米探针用于MRA的关键优势，理解纳米探针与血管内皮之间的相互作用值得在未来研究中专门探讨。

研究结论部分翻译：总之，Fe@POS纳米探针作为一种无钆T1加权磁共振对比剂，具有用于心血管系统高分辨率和延长T1加权MRA的潜力。与Gd-DTPA相比，这种新型Fe(III)基纳米探针具有以下优势：（1）延长的血管滞留时间；（2）高空间分辨率MRA；（3）在动物实验中确认的生物安全性。本研究改善了MR对比剂的生物相容性和体内循环时间，并可能在临床实践中部分替代GBCAs。