琥珀酸脱氢酶缺失在两种细胞背景下的蛋白质组与酰基化蛋白质组适应性差异

《Journal of Biological Chemistry》：Distinct proteomic and acylproteomic adaptations to succinate dehydrogenase loss in two cell contexts

　　

三羧酸循环（TCA）和电子传递链（ETC）是细胞产生ATP所需的关键代谢途径。尽管这些组分的缺失会损害细胞存活，但这种缺陷反而可能促进肿瘤发生。琥珀酸脱氢酶（SDH）缺失即是其中一例，SDH同时参与TCA循环并作为ETC的复合物II发挥功能。SDH亚基突变可导致嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PPGL），后者是发生于肾上腺嗜铬细胞和神经节中的罕见遗传性神经内分泌肿瘤。SDH缺失后肿瘤形成为何仅限于特定组织尚不清楚。研究人员假设SDH缺失所致的代谢和蛋白质组扰动具有细胞类型特异性，从而有利于嗜铬细胞的存活。研究人员全面检测了SDH缺失在两种细胞模型——永生化小鼠嗜铬细胞（imCCs）和永生化小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）——中的蛋白质组、乙酰化蛋白质组和琥珀酰化蛋白质组效应。代谢物水平扰动通过质谱法测定。SDH缺失对脂肪酸β-氧化（FAO）的影响通过稳定同位素示踪和药理学抑制进行评估。SDH缺失的imCCs显示线粒体蛋白显著上调，包括TCA循环和FAO酶，同时核蛋白显著下调。SDH缺失后，imCCs和iMEFs均表现显著的能量缺乏，但FAO活性仅在SDH缺失的imCCs中独特增加。尽管SDH缺失使赖氨酸反应性乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A均增加，SDH缺失的imCCs和iMEFs表现出不成比例的高乙酰化但混合的琥珀酰化变化。令人惊讶的是，SDH缺失的imCCs而非iMEFs显示线粒体蛋白不成比例的低乙酰化和低琥珀酰化。SDH缺失对imCCs和iMEFs的蛋白质组和酰基化蛋白质组的影响存在差异，并具有区室特异性效应。这些发现揭示了SDH缺失的细胞类型特异性适应。imCCs反应的塑性可能 underlie 组织特异性肿瘤易感性，并可能为SDH缺失肿瘤的治疗脆弱性提供启示。

研究背景方面，三羧酸循环（TCA）和电子传递链（ETC）是维持细胞能量和代谢物稳态的关键通路。糖酵解和脂质分解代谢的输入进入TCA循环，通过ETC支持ATP产生并为代谢物和脂肪酸合成提供前体。尽管TCA循环在维持能量和代谢物池中具有关键作用，但TCA循环酶的缺失反而可促进胶质瘤、神经内分泌肿瘤和肾细胞癌的肿瘤发生。SDH亚基及其组装因子以及MDH2、FH、IDH3B和DLST的功能丧失性突变使个体易患嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PPGL），后者分别是肾上腺和神经节中嗜铬细胞的罕见神经内分泌肿瘤，表明TCA循环功能障碍与PPGL肿瘤发生之间存在独特联系。SDH缺失纯合致死，杂合携带者无表型但存在剩余功能性SDH亚基基因的随机二次打击风险，导致受影响细胞中SDH完全缺失。然而，SDH缺失驱动肿瘤的组织特异性仍知之甚少。SDH复合物由四个核编码亚基（SDHA-D）组成，需要四个组装因子（SDHAF1-4）进行正确成熟。PPGL肿瘤发生的主导模型认为TCA循环中断导致中间产物积累作为致癌代谢物。特别是SDH缺失后琥珀酸堆积可竞争性抑制数十种2-酮戊二酸依赖性双加氧酶。研究人员一直 pursuing 两个主要问题：（i）除琥珀酸毒害双加氧酶外的其他致病机制是否解释SDH缺失PPGL的更高致病性；（ii）PPGL肿瘤发生独特组织特异性的基础是什么。在近期先前工作中，研究人员证明SDH缺失的iMEFs和imCCs在应对SDH缺失方面存在差异重构。因此，先前分析揭示了SDH缺失iMEFs与肾上腺来源SDH缺失imCCs之间显著不同的残余代谢特征。除琥珀酸积累外，SDH缺失导致的TCA循环阻断可能导致其他上游代谢物积累。乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A作为高反应性代谢物能够翻译后酰化赖氨酸侧链ε-氨基。然而，代谢失调背景下蛋白质酰化改变更广泛的意义仍知之甚少，PPGL中的具体效应尚待探索。研究人员进行了串联质量标签（TMT）标记的定量蛋白质组和酰基化蛋白质组分析，以全面检测SDH缺失在小鼠肾上腺来源细胞与成纤维细胞中的效应。研究人员试图确定SDH缺失如何（i）改变蛋白质组和（ii）改变全蛋白质组的赖氨酸乙酰化和琥珀酰化。研究人员利用可用模型，即含SDH vs. SDHC缺失的永生化小鼠成纤维细胞（iMEFs）和含SDH vs. SDHB缺失的永生化小鼠肾上腺细胞（imCCs）。研究人员提出两个假设：第一，肾上腺来源细胞而非成纤维细胞对PPGL肿瘤发生的组织偏好将表现为imCCs对SDH缺失的独特蛋白质组反应，反映肾上腺细胞存活代谢损伤的更大能力；第二，SDH缺失细胞中赖氨酸反应性乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A增加，导致全局蛋白质高酰化。总之，研究人员的发现表明细胞类型特异性的蛋白质组和酰基化蛋白质组适应SDH缺失有利于特定细胞类型（此处为肾上腺来源细胞）的存活，这些细胞能更好地补偿缺陷的能量代谢。这一观察可能有助于解释某些组织对SDH缺失驱动肿瘤发生的选择性脆弱性。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：TMT标记的定量蛋白质组学和酰基化蛋白质组学分析，结合免疫亲和富集赖氨酸乙酰化和琥珀酰化肽段，通过Orbitrap Eclipse质谱仪进行nanoLC-串联质谱数据采集；液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A、FAD、ATP、ADP、NAD⁺和NADH；稳定同位素示踪（[U-¹³C]-棕榈酸）结合GC-MS评估FAO活性；以及活细胞双荧光报告系统检测sirtuin脱乙酰酶活性。细胞模型方面，imCCs来源于Sdhb^fl/fl小鼠肾上腺髓质，iMEFs来源于Sdhc^fl/fl小鼠。

研究结果方面，第一，SDH缺失差异性改变imCCs和iMEFs的蛋白质组。通过TMT蛋白质组学分析发现，SDH缺失对imCCs蛋白质组影响更大（34%蛋白质显著改变 vs. iMEFs的18%）。IPA显示共享变化包括胶原生物合成上调和翻译、rRNA加工及细胞周期调控下调。线粒体脂肪酸β-氧化、TCA循环酶成熟/调控、线粒体蛋白降解、线粒体铁硫簇生物合成和线粒体分裂信号五条线粒体通路在SDH缺失imCCs中上调，而SDH缺失iMEFs中无线粒体通路显著失调。第二，SDH缺失imCCs显示亚细胞区室特异性蛋白质组变化。通过UniProtKB注释列表提取线粒体、细胞核和细胞质蛋白亚群进行分析，发现仅imCCs显示SDH缺失后线粒体蛋白显著上调，核蛋白下调在imCCs中更为显著。第三，SDH缺失诱导深刻低能量细胞状态。通过LC-MS测量能量平衡，发现两种SDH缺失细胞均显示ATP/ADP比值显著降低和NAD⁺/NADH比值升高。第四，SDH缺失后线粒体蛋白质组发生细胞类型特异性改变。通过DAVID功能注释发现脂肪酸代谢相关通路是SDH缺失imCCs中最显著富集的簇，TCA循环和FAD结合蛋白也显著富集。LC-MS定量显示FAD在SDH缺失imCCs中独特增加两倍以上。第五，SDH缺失导致蛋白质乙酰化和琥珀酰化混合改变。通过免疫富集TMT蛋白质组学鉴定imCCs中1444个乙酰化蛋白和1908个琥珀酰化蛋白，iMEFs中883个乙酰化蛋白和1896个琥珀酰化蛋白。SDH缺失imCCs和iMEFs均显示不成比例的高乙酰化，但琥珀酰化变化混合。第六，SDH缺失导致亚细胞区室蛋白质酰化差异性改变。线粒体蛋白在两种细胞中均经历SDH缺失诱导的高乙酰化，但线粒体高琥珀酰化仅在imCCs中检测到。核蛋白在imCCs中显示低乙酰化，但两种细胞均显示不成比例的核蛋白高乙酰化和高琥珀酰化。细胞质蛋白在两种细胞中均显示不成比例的高乙酰化和高琥珀酰化。

讨论部分总结：PPGL肿瘤病因学在多个层面仍不清楚。尽管SDH缺失和VHL缺失肿瘤共享HIF转录因子慢性激活和假性缺氧，SDH缺失肿瘤比VHL缺失肿瘤更具侵袭性。本研究通过详细定量分析证明SDH缺失显著改变两种永生化小鼠细胞系模型的蛋白质组和酰基化蛋白质组。SDH缺失后imCCs和iMEFs均发生深刻能量缺乏，但仅SDH缺失imCCs显示线粒体TCA循环和FAO蛋白上调及FAO活性增加。尽管两种SDH缺失细胞模型中赖氨酸反应性乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A均积累，蛋白质一般显示不成比例的高乙酰化，但琥珀酰化水平变化混合。研究结论翻译：总之，本研究结果表明SDH缺失施加深刻的能量缺乏状态，在两种细胞模型中引起显著的细胞类型特异性变化影响蛋白质组和酰基化蛋白质组。本研究揭示了SDH缺失细胞经历的能量缺陷的细胞类型特异性适应，并表明SDH缺失imCCs具有优越的代谢塑性，从而为SDH缺失如何在某些组织中被选择性耐受提供了线索。