Pyk2支架作用解除Src自抑制以协调相互激酶激活

《Journal of Biological Chemistry》：Pyk2 scaffolding relieves Src autoinhibition to coordinate reciprocal kinase activation

　　

Pyk2与Src是非受体酪氨酸激酶，二者组装成复合物以促进相互激活。Pyk2的FERM结构域通过与激酶直接相互作用介导自抑制。Src自抑制由SH3和SH2结构域与内部配体（包括抑制性C端磷酸酪氨酸）的分子内相互作用维持。FERM解离允许Pyk2对FERM–激酶连接区进行自磷酸化，生成用于招募Src的支架位点。尽管Src介导的Pyk2激活环磷酸化已充分确立，但复合物形成激活Src的机制仍不清楚。研究人员重建了两种激酶的明确磷酸化和调控状态，结合定点突变与磷酸化位点分辨的活性谱分析来解析相互调控。Src通过随机、分配性机制磷酸化Pyk2激活环的两个酪氨酸，位点间存在负协同性。尽管活化的Pyk2能有效磷酸化Src激活环，但Pyk2–Src复合物形成并未显著提高激活环磷酸化水平超过单独Src自磷酸化的速率。相反，自抑制的Src严格需要Pyk2支架参与才能有效磷酸化Pyk2。因此，Pyk2通过呈递竞争性支架位点来解除分子内SH3和SH2构象限制，从而解除Src自抑制。结果区分了激活环磷酸化与底物磷酸化所需的构象能力。研究人员提出，自磷酸化的Pyk2主要作为构象激活剂和支架平台发挥作用，使Src开放以供磷酸酶介导的抑制性C端磷酸位点去除，并使Pyk2和Src共同致力于下游底物磷酸化。

研究背景方面，Pyk2（富含脯氨酸的酪氨酸激酶2）和Src是非受体酪氨酸激酶，在细胞信号通路中协同促进相互激活和信号传导。激酶活性的严格调控对于维持响应性、稳健性和保真性至关重要。激酶在多种活性状态之间转换，受磷酸化、定位和调控相互作用调节。特别是激酶激活环的磷酸化组织活性位点，增强底物可及性并促进更高的磷酸转移活性。通过构象变化和磷酸化激活激酶需要协调的蛋白质–蛋白质相互作用以确保稳健的信号转导。Pyk2是黏着斑激酶（FAK）的唯一旁系同源物，具有65%的序列相似性和相当的域组织。尽管共享进化起源，但两种激酶在表达模式、亚细胞定位、激活机制和信号输出方面已经分化。FAK定位于膜，通过脂质相互作用和黏着斑处的聚集激活，在细胞黏附、迁移、增殖和胚胎发育中具有信号作用。相反，Pyk2保留胞质定位，并在神经元细胞中响应Ca²⁺通量。在其他细胞类型如内皮细胞和巨核细胞中，Pyk2保留更传统的FAK样定位和功能。神经元Pyk2富集于突触后密度并与突触可塑性相关。Pyk2功能障碍涉及神经系统疾病，如亨廷顿病和阿尔茨海默病。尽管定位和激活刺激存在显著差异，Pyk2保留了FAK多阶段激活机制的关键特征，包括需要Src家族激酶（SFK）招募以实现激活环磷酸化。Pyk2和FAK均含有N端调控FERM（protein 4.1/ezrin/radixin/moesin）结构域、中心酪氨酸激酶和C端FAT（focal adhesion targeting）结构域。Pyk2和FAK通过FERM与激酶相互作用而受抑制，阻断活性位点进入。虽然细节仍不明确，但聚集和FERM重排的组合可解除FERM抑制。对于FAK，激活触发涉及二聚化、膜结合和由磷酸肌醇与FERM结构域碱性 patch 结合介导的聚集。FAK和Pyk2的去抑制特征是多域架构的开放，释放激酶以获得有限的磷酸转移功能。随后，FERM–激酶连接区酪氨酸Y402（FAK中为Y397）发生自磷酸化。自磷酸化的连接区酪氨酸（pY402）和近端富含脯氨酸区域作为串联Src SH2和SH3结构域的高亲和力对接位点。然后Src磷酸化Pyk2激活环残基Y579/Y580（FAK中为Y576/Y577），使激酶转变为完全活性状态。因此，FAK和Pyk2作为信号酶和支架发挥双重作用。例如，Src与FAK/Pyk2的支架相互作用为活化的Src靶向通路特异性下游效应器提供了平台。Pyk2激活的现行模型是主要继承自更充分表征的FAK系统的逐步级联。氢/氘交换质谱表明存在保守的自抑制机制，自抑制界面与FERM碱性 patch 之间存在有趣的正构连接。然而，Pyk2激活机制尚不明确。Pyk2响应Ca²⁺内流和支架介导的聚集而非膜招募。重要的是，Pyk2起始刺激的方向性仍不明确。基于细胞的研究表明，聚集诱导的Pyk2 Y402反式自磷酸化先于Src招募。然而，其他基于细胞的系统表明Src是启动Pyk2（而非FAK）连接区酪氨酸磷酸化所必需的。鉴于细胞信号传导的复杂、多因素输入和整合，不同模型可能代表共享下游激活级联的不同入口点。Src家族激酶是参与众多细胞通路的著名信号枢纽。SFK功能包括细胞增殖、运动、细胞周期调控和受体介导的信号转导。Src是Src激酶家族的原型成员，也是第一个被发现的酪氨酸激酶原癌基因。Src功能障碍涉及多种癌症，使Src成为关键治疗靶点。Src含有N端SH3结构域，随后是SH2结构域和C端酪氨酸激酶。Src的构象排列源于磷酸化和SH2与SH3结构域分子内相互作用的相互作用。构象重排是SFK调控的基础，其中SH2/SH3相互作用的竞争与激酶激活相关。Src自抑制由分子内相互作用维持，这些相互作用将激酶结构域楔入催化无能构象。C端（Y530）被CSK（C端Src激酶）磷酸化产生SH2结构域的内部配体，而SH3结构域结合SH2–激酶连接区中的假配体，形成次优分子内相互作用。Src激活通过竞争性配体结合置换分子内SH2/SH3相互作用、激活环磷酸化以及共定位磷酸酶同时去磷酸化C端Y530来实现。例如，受体酪氨酸激酶（如表皮生长因子受体和血小板衍生生长因子受体）呈递细胞内基序以招募和激活Src。SH2或SH3介导的分子内相互作用的置换引发基于支架的激活。Src激活环（Y419）的磷酸化稳定激酶结构域的活性构象，赋予最高水平的磷酸转移活性。重要的是，两种激活输入在SFK中是离散且可分离的，因为激活环自磷酸化并不覆盖分子内SH2/SH3相互作用的调控控制。因此，Src激活环磷酸化和构象释放代表不同的调控状态。在细胞中，Pyk2–Src或FAK–Src复合物的形成不仅导致Pyk2/FAK激活，也导致Src激活。Pyk2（而非Pyk2 Y402F）的过表达导致Src激活环磷酸化（pY419）增加。FAK和Pyk2连接区自磷酸化位点均已发现可结合Src SH2结构域。与附近富含脯氨酸区域相比，当pY402进入受阻时，Src介导的Pyk2激活环磷酸化受损更显著。总之，FAK和Pyk2自磷酸化位点作为有效的Src SH2配体，复合物形成增加Src活性。Src激活可能依赖于当Pyk2呈递串联SH2/SH3对接位点以竞争胜过Src分子内相互作用时自抑制的释放。然而，导致Src和Pyk2相互磷酸化的相互作用和磷酸化进程仍不清楚。在细胞中，Pyk2与Src之间的相互作用最终引发两种激酶的激活，但机制细节仍不清楚。Src可能需要上游信号因子在Pyk2参与之前预激活。或者，Src可能保持自抑制直到Pyk2结合解除构象抑制。同样，仍不清楚Pyk2是否负责Src激活环磷酸化，或仅支架是否足以促进Src自磷酸化。本研究从纯化组分重建Pyk2–Src复合物并解析位点特异性磷酸化事件，以区分直接磷酸化与构象调控。利用明确的体外系统，研究人员阐明了相互激酶激活的机制基础和协作信号作用。体外解析复合物允许分离Src依赖步骤与需要Pyk2聚集的步骤，确定Pyk2对Src激活环磷酸化的贡献，并评估复合物内Src激活在多大程度上由支架驱动的构象解除而非激活环磷酸化所支配。

研究人员开展的研究方面，通过共孵育Src和Pyk2可在体外驱动两种激酶达到最大磷酸化和活性，该过程可能涉及Src和Pyk2激活环的磷酸化。有趣的是，Pyk2是几种需要多个激活环酪氨酸磷酸化的激酶之一，包括FAK、IRK、IGF1R、MET和Jak2。磷酸化的激活环酪氨酸通过与周围碱性口袋的静电相互作用网络稳定Pyk2活性位点。Pyk2在基础或活性状态下，对任一激活环残基Y579或Y580的自磷酸化可忽略不计。完整蛋白质质谱（MS）证实Src在Pyk2激活环磷酸化中的作用。在ATP孵育之前，Pyk2显示单一未磷酸化质量。自磷酸化后，信号移至与Pyk2单磷酸化（+80 Da）在Y402一致的质量。加入Src产生额外的Pyk2种类，与10分钟时间进程内额外一个和两个磷酸化一致。因此，Src似乎负责两个相邻Pyk2激活环残基的磷酸化。然而，任一酪氨酸单磷酸化后，Pyk2激活环的局部静电和空间位阻显著改变，需要Src灵活的底物识别。如果Src负责Pyk2激活环中两个酪氨酸的磷酸化，研究人员想知道Src是否对任一Pyk2残基表现出有序或优先磷酸化。为研究Src介导的双重磷酸化是否偏好任一激活环残基Y579或Y580，研究人员通过液相色谱串联MS（LC-MS/MS）监测位点特异性磷酸化。基于碎片离子鉴定和定量单磷酸化和双磷酸化激活环残基，并在60分钟时间进程中监测。磷酸化引入的电荷扰动可抑制肽段电离，因此研究人员优化了蛋白水解条件以生成一个激活环肽段，用于无偏同时定量单磷酸化pY579或pY580。Src对一个激活环酪氨酸相对于另一个的偏好可忽略不计。然而，任一位点的单磷酸化似乎减慢邻近位点的磷酸化，如单磷酸化中间体积累所证明。显然，Src识别未磷酸化激活环的任一酪氨酸，但单磷酸化的改变静电抑制Src对第二个相邻酪氨酸的识别。尽管如此，Src底物特异性足够可塑，能双重磷酸化Pyk2的两个串联激活环残基。在细胞中，Pyk2和FAK与Src相互作用，促进Src激活。然而，尚不清楚Pyk2是否直接负责Src激活环（Y419）磷酸化。鉴于在Src磷酸化Pyk2期间两种蛋白质激活环的支架邻近性，研究人员试图测试Pyk2是否能在体外反向磷酸化Src Y419。为聚焦于Pyk2介导的Src激活环磷酸化，研究人员通过使用激酶死亡（K298M）Src变体限制Src活性。用基础（pY402，未磷酸化环）或完全活性（pY579/pY580）Pyk2测试K298M Src的激活环磷酸化。虽然基础Pyk2不能磷酸化Src Y419，但活性Pyk2强烈磷酸化Src Y419。Pyk2介导的Src Y419磷酸化程度约为WT Src自磷酸化观察水平的60%。值得注意的是，Src活性可能相对于Pyk2被夸大，因为Src自磷酸化随着反应进展受自催化放大影响（即产物pY419 Src被激活以进行快速、持续的反式自磷酸化）。Src激活环磷酸化具有两个主要作用：增强催化活性和影响底物特异性。研究人员已确定Pyk2可促进Src激活环磷酸化，然而Pyk2激活环磷酸化是先决条件，存在明显的循环依赖。如果Pyk2在细胞中有助于Src激活环磷酸化，则需要上游激酶进行先前的Pyk2激活环磷酸化。研究人员想知道未磷酸化Src的基础活性是否足以在招募到磷酸化Pyk2连接区位点pY402后靶向并磷酸化Pyk2激活环。为评估Src激活环磷酸化是否为有效识别和磷酸化Pyk2激活环所必需，研究人员生成了不可磷酸化的环变体Y419F Src。然后研究人员用WT Src或Y419F Src在体外磷酸化pY402 Pyk2 FERM-激酶激活环。值得注意的是，WT和Y419F Src均容易磷酸化Pyk2残基Y579/Y580，表明基础Src活性足以磷酸化Pyk2激活环。虽然Src在某些情况下可启动Pyk2 FERM—激酶连接区位点（Y402）的磷酸化，但由聚集促进的反式自磷酸化被认为是控制Pyk2连接区磷酸化的主要机制。然而，先前对Src介导的Pyk2连接区磷酸化的研究因伴随的激活环磷酸化和Pyk2活性的自催化放大而复杂化。为阐明Src磷酸化Pyk2位点Y402的程度，研究人员用激酶死亡Pyk2变体K457A测试Y419F Src。有趣的是，Y419F变体也能磷酸化Y402自磷酸化位点，尽管比WT Src慢。然而，Src激活环磷酸化所赋予的增强活性对Y402磷酸化是独特的；当呈递pY402对接位点时，WT和Y419F Src对Pyk2激活环表现出相当的活性。总之，结果表明通过pY402 Pyk2的支架作用是获得稳健Src活性的途径。虽然Pyk2介导的磷酸化（pY419）可促进Src激活，但研究人员还想测试Pyk2是否能在Src活性的构象刺激中发挥作用。几种信号系统通过竞争胜过自抑制分子内SH2/SH3相互作用触发Src家族激酶激活。已知Pyk2和FAK需要Src SH2结合进行激活环磷酸化，表明磷酸化FERM—激酶连接区作为优选的Src对接位点。实际上，磷酸化Pyk2 FERM—激酶连接区呈递的串联SH2/SH3配体（即pY402和富含脯氨酸区域）提供了潜在高亲和力Src支架位点。因此，自磷酸化Pyk2可能通过竞争胜过自抑制SH2/SH3相互作用对Src活性施加构象控制，独立于激活环磷酸化。研究人员旨在使用体外定义的激酶调控状态测试Pyk2支架对Src活性的影响。为确定Pyk2是否可作为Src的构象激活剂，研究人员首先需要生成自抑制Src。Src激活环自磷酸化后，激酶结构域锁定在活性状态。为聚焦于构象控制并排除Src自磷酸化，研究人员从不可磷酸化Y419F Src开始。自抑制Y419F Src通过用CSK处理生成，CSK是负责磷酸化Src C端（Y530）以形成分子内SH2配体的激酶。研究人员在此使用"自抑制"表示完全组装的pY530状态，因为未磷酸化Src保留SH3–连接区相互作用以部分抑制。为确认CSK处理的pY530 Src活性受抑制，研究人员部署Y402F Pyk2作为非支架磷酸受体底物。Pyk2 pY402位点是Src对接的主要决定因素，因此Y402F Pyk2呈递已知Src磷酸化靶位点（Y579/Y580），同时缺乏双齿SH3/SH2接合所需的磷酸酪氨酸。实际上，基础活性Y419F Src（无CSK处理）仍实现Pyk2激活环磷酸化。然而，CSK处理的自抑制Y419F Src对Y402F Pyk2磷酸化无可检测水平。虽然Pyk2富含脯氨酸区域原则上可允许SH3介导的激活，但pY530 Src对Y402F Pyk2磷酸化的缺失表明仅富含脯氨酸区域不足以解除Src自抑制。因此，研究人员的体外系统再现了CSK介导的C端磷酸化后的严格Src自抑制。接下来，研究人员直接测试具有自磷酸化FERM—激酶连接区（pY402）的Pyk2是否足以刺激自抑制（pY530）Y419F Src活性。开放基础（无CSK处理）或自抑制（pY530）Y419F Src与pY402 Pyk2孵育。为揭示Pyk2是否能竞争胜过Src自抑制，研究人员监测Pyk2激活环磷酸化作为Src激活的指标。Pyk2和CSK单独的对照未显示激活环磷酸化，确认CSK对Src的特异性。如先前观察，基础状态Y419F Src容易磷酸化Pyk2激活环。虽然pY530将Src限制为对非支架Pyk2底物的可忽略活性，但当Src以pY402 Pyk2作为底物呈递时，pY530自抑制被克服且活性恢复。实际上，pY402 Pyk2足以刺激pY530 Src活性，尽管程度仅为未抑制Src基础活性的一部分。因此，Pyk2连接区磷酸化可解除Src自抑制，独立于Src激活环磷酸化。迄今为止，研究人员观察到完全磷酸化的活性（pY579/pY580）Pyk2容易磷酸化Src激活环，而Src不需要激活环磷酸化来激活Pyk2。这些发现支持涉及相互激酶磷酸化级联的调控模型。在细胞中，两种天然激酶访问动态构象和磷酸化诱导的调控景观。自催化放大可通过反式自磷酸化快速传播激活环磷酸化，而支架可同时促进构象重排和底物邻近。为测试有序的相互磷酸化机制是否可行，研究人员在体外使用具有完全磷酸化潜力的WT激酶重建了明确的Pyk2/Src系统。通过平衡CSK和酪氨酸磷酸酶YopH活性，研究人员生成了处于明确（去）磷酸化起始状态的WT Src和Pyk2 FERM–激酶。简言之，Src如前所述通过与CSK和ATP孵育以磷酸化C端而自抑制。自抑制pY530 Src然后用YopH处理以将Src激活环重置为去磷酸化状态。已知自抑制Src构象保护pY530免受磷酸酶活性，如研究人员通过免疫印迹确认。随后用原钒酸盐抑制YopH以允许后续激酶测定。同时，进行免疫印迹以确认pY402 Pyk2通过自磷酸化生成，无可检测的激活环磷酸化。为测试CSK/磷酸酶处理是否在WT pY530 Src中再现自抑制，研究人员使用非支架Y402F Pyk2作为磷酸受体底物比较CSK/磷酸酶处理的WT Src与开放状态（未处理）WT Src的活性。与Y419F Src相似，自抑制WT Src对Y402F Pyk2激活环磷酸化无可检测水平。开放（未磷酸化）Src快速磷酸化pY402 Pyk2，也反映Y419F Src。当呈递支架相互作用的可能性时，自抑制WT Src实现pY402 Pyk2激活环的稳健磷酸化。接下来，研究人员假设pY402 Pyk2可能通过解除自抑制Src构象的支架相互作用促进有效的Src激活环磷酸化。因此，支架化的Src可磷酸化Pyk2激活环，赋予Pyk2用于磷酸化Src激活环的有效激活状态。为确定Pyk2是否也促进相互的Src激活环磷酸化，研究人员监测有或无pY402 Pyk2的自抑制Src的Src激活环磷酸化。有趣的是，有或无pY402 Pyk2的自抑制Src表现出相似的稳健pY419磷酸化速率。如预期，用Y419F Src重复的对照中未检测到Src激活环磷酸化。总之，Src C端磷酸化急剧限制靶向Pyk2激活环的激酶活性，除非pY402可用于支架相互作用。然而，C端磷酸化并不排除Src激活环的自磷酸化。

为开展研究用到的主要关键技术方法方面，研究人员采用了定点突变技术构建多种激酶变体（如Y419F Src、K298M Src、K457A Pyk2、Y402F Pyk2），结合磷酸化位点分辨的活性谱分析（phosphosite-resolved activity profiling）解析相互调控；利用数据非依赖采集液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行位点特异性磷酸化定量分析；采用完整蛋白质质谱（intact protein MS）监测Pyk2磷酸化种类变化；通过体外重建激酶反应体系结合Western blot和dot blot进行位点特异性磷酸化检测；使用CSK（C端Src激酶）和YopH酪氨酸磷酸酶处理生成定义调控状态的Src；蛋白纯化采用Ni-NTA亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析等方法。样本队列来源为重组蛋白体外表达纯化系统（NiCo21(DE3)等表达菌株），非临床样本队列。

研究结果方面，第一，Src磷酸化Pyk2激活环。通过LC-MS/MS监测60分钟时间进程中Pyk2激活环肽段（残基578–595）的四种肽形式（未磷酸化Y579/Y580、pY579、pY580和pY579/pY580），发现Src对任一激活环酪氨酸的偏好可忽略不计，但任一位点单磷酸化似乎减慢邻近位点磷酸化，表现为单磷酸化中间体积累。Src以随机、分配性机制磷酸化两个串联激活环酪氨酸，位点间存在负协同性。完整蛋白质MS证实Src负责Pyk2激活环两个残基的磷酸化。第二，Pyk2磷酸化Src。通过使用激酶死亡K298M Src变体，发现基础Pyk2不能磷酸化Src Y419，而活性Pyk2强烈磷酸化Src Y419，程度约为WT Src自磷酸化的60%。第三，Src激活环磷酸化不是激活Pyk2所必需。通过Y419F Src与pY402 Pyk2孵育，发现WT和Y419F Src均容易磷酸化Pyk2残基Y579/Y580，表明基础Src活性足以磷酸化Pyk2激活环。Y419F变体也能磷酸化Y402自磷酸化位点，但比WT Src慢。第四，Pyk2支架作用竞争胜过Src自抑制。通过CSK处理生成自抑制pY530 Y419F Src，发现其对非支架Y402F Pyk2无 detectable 磷酸化，但pY402 Pyk2足以刺激pY530 Src活性， albeit 程度为未抑制Src基础活性的一部分。表明Pyk2连接区磷酸化可解除Src自抑制，独立于Src激活环磷酸化。第五，重建Pyk2和Src相互激活环磷酸化。通过CSK/YopH处理生成定义状态的WT Src和Pyk2，发现自抑制WT Src对Y402F Pyk2无磷酸化，但pY402 Pyk2存在时自抑制WT Src实现Pyk2激活环稳健磷酸化。有趣的是，有或无pY402 Pyk2的自抑制Src表现出相似的pY419自磷酸化速率，表明Src激活环磷酸化主要由快速自催化反式自磷酸化主导，Pyk2的机制贡献主要为构象控制。

讨论部分总结，Src和Pyk2经历多步骤构象重排，最终导致两种激酶激活。本研究用定义调控状态重建Pyk2/Src系统以解析相互激活环磷酸化的机制要求，并提供Pyk2介导Src构象激活的直接证据。几个机制主题浮现：首先，激活环磷酸化和磷酸受体接合的构象能力是可分离的输出。区分二者阐明了Pyk2–Src复合物的相互调控，并调和了最初看似矛盾的观察。最终，研究结果细化了Src和Pyk2之间协调、相互激活控制的机制模型。Src通过随机磷酸化第一个酪氨酸且对第二个酪氨酸磷酸化具有 apparent 负协同性来磷酸化Pyk2激活环。由于Pyk2激活环自磷酸化可忽略不计，Src负责两个串联激活环酪氨酸的磷酸化。Src对每个Pyk2位点特异性的近乎等同可通过激酶序列基序特异性分析研究合理化。两个位点均未提供特别优化的Src底物。负协同性不太容易由内在Src序列特异性解释。研究人员推测构象约束阻碍Src对第二个酪氨酸的识别，因为单磷酸化开始有序化Pyk2激活环。研究人员还发现完全活性Pyk2可直接磷酸化Src激活环Y419，但基础状态Pyk2不能。相互Pyk2/Src磷酸化高效，尽管比Src自磷酸化慢，可能由复合物形成期间两个激活环的紧密并置促进。值得注意的是，用WT Src组装支架化复合物并未增强Src激活环磷酸化超过单独Src自磷酸化水平。这一观察表面上与Pyk2介导稳健Src激活环磷酸化的观察冲突。研究人员通过推断Src激活环磷酸化由快速自催化反式自磷酸化主导来调和两个结果。Src自抑制状态保持相对动态，采样活性样构象。从自抑制状态设法自磷酸化的小的Src亚群快速传播激活环磷酸化，独立于Pyk2。因此，虽然Pyk2有能力磷酸化Src激活环，但当高局部浓度的Src可用于反式自磷酸化时，该活性功能冗余。相反，Pyk2的机制贡献似乎为构象控制。重要的是，Pyk2调控作用的冗余性取决于Src丰度。在细胞中，Src激活受空间限制，可用于自磷酸化的Src局部浓度随膜招募和支架变化。在Src稀疏或新招募的地方，活化Pyk2的直接磷酸化可能对激活环磷酸化贡献更大。相反，在Src密集聚集的位点，自催化途径可能占主导。基于支架的构象激活是化学计量和浓度非依赖的。每个pY402 Pyk2解除一个接合Src的自抑制。因此，Pyk2的构象贡献可能是跨细胞背景更稳健的调控模式。自抑制（pY530）Src不能磷酸化非支架底物（如Y402F Pyk2），然而当呈递pY402 Pyk2的串联SH3/SH2配体时，自抑制Src有效磷酸化Pyk2激活环。因为支架作用用不可磷酸化Y419F Src挽救活性，磷酸化Pyk2连接区解除Src自抑制独立于Src激活环磷酸化。研究人员将Pyk2介导的激活解释为Src的基于支架的构象激活，其中相邻富含脯氨酸区域和pY402竞争胜过将Src约束在催化无能状态的分子内SH3/SH2相互作用。自抑制WT Src对Pyk2激活环的支架化磷酸化比开放基础Src慢，如预期如果有效接合需要竞争胜过分子内SH2和SH3相互作用。基于支架的构象激活对Src调控赋予重要后果。在自抑制构象中，C端pY530受磷酸酶活性保护，如研究人员通过免疫印迹证明。Pyk2支架解除自抑制将使pY530暴露于共定位磷酸酶，使Src致力于稳定、高活性状态。该模型由Src激活环与C端磷酸基序之间的正构偶联强化。因为即使激活环磷酸化时pY530仍可约束激酶，激活环状态单独不定义活性状态。Src因此可携带pY419同时保持构象自抑制，只有支架介导的SH2/SH3置换和磷酸酶介导的pY530去除组合才能产生对其他底物信号伙伴的最大、承诺活性。这一区分阐明了pY530 Src稳健自磷酸化与Src C端磷酸化对Pyk2激活环磷酸化严格阻断之间 apparent 不一致。Pyk2的调控逻辑同样分层。在自抑制状态，Pyk2 FERM结构域直接遮蔽激活环和底物对接裂隙，同时 sequestering 作为Src对接位点的Y402。Pyk2自抑制的解除在Src接合上游。为访问Pyk2基础活性状态，FERM结构域必须瞬时解离以允许Pyk2对Y402的反式自磷酸化，该步骤独立于Src进行。由此产生的pY402支架位点解除Src自抑制，使Src能磷酸化Pyk2激活环，这是Pyk2单独无法实现的。支架还可能允许Src竞争胜过 tethered FERM结构域以接近Pyk2激活环。完全磷酸化的Pyk2激活环随后致力于最大激活，因为磷酸化阻止FERM抑制性相互作用重新接合。FERM释放的触发仍未解决，但提出的机制包括FERM介导的二聚化、Ca²⁺/钙调蛋白诱导的聚集和PSD-95支架作用。总之，研究结果支持Pyk2和Src激活通过相互接合偶联的模型，尽管调控依赖性是不对称的。Pyk2受FERM自抑制和激活环磷酸化对Src依赖性的门控。Src受分子内SH2/SH3自抑制和C端pY530的门控。在该模型中，活化Pyk2与其说是Src激活环的直接上游激酶，不如说是构象激活剂和支架平台。Pyk2可有助于解除Src自抑制，暴露Src C端以供磷酸酶作用，并定位最大激活的Src以磷酸化下游效应器。研究结果细化了Pyk2和FAK作为双重信号酶和支架的长期观点，阐明了激活背后的有序、相互调控事件。

研究结论部分翻译：Pyk2和Src经历多步骤构象重排，最终导致两种激酶激活。本研究用定义调控状态重建Pyk2/Src系统以解析相互激活环磷酸化的机制要求。此外，研究人员提供Pyk2介导Src构象激活的直接证据。总之，几个机制主题浮现。首先，激活环磷酸化和磷酸受体接合的构象能力是可分离的输出。区分二者阐明了Pyk2–Src复合物的相互调控，并调和了最初看似矛盾的观察。最终，研究结果细化了Src和Pyk2之间协调、相互激活控制的机制模型。