《Journal of Biological Chemistry》：Structural basis of phospholipid sensing nuclear receptor LRH-1 recognition by carboxylic acid bioisosteres reveals an alternative ligand interaction site
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肝受体同源物-1（LRH-1；NR5A2）是一种磷脂感应核受体，调控肝脏、肠道和胰腺中的代谢与类固醇生成通路。此前，研究人员已证明，带有羧酸"尾部"的小分子LRH-1激动剂可模拟内源性磷脂在配体结合口袋入口处的接触，从而增强受体激活。为在保留这些关键相互作用的
肝受体同源物-1（LRH-1；NR5A2）是一种磷脂感应核受体，调控肝脏、肠道和胰腺中的代谢与类固醇生成通路。此前，研究人员已证明，带有羧酸"尾部"的小分子LRH-1激动剂可模拟内源性磷脂在配体结合口袋入口处的接触，从而增强受体激活。为在保留这些关键相互作用的同时提高代谢稳定性，研究人员设计了一系列激动剂，将羧酸酯替换为生物电子等排的极性基团。在先导激动剂中以四唑替换羧酸酯，可保持高亲和力LRH-1结合，提高细胞报告基因实验中的效力，并促进更强的靶基因诱导。引入磺酰胺部分以促进LRH-1结合口袋深部的相互作用，得到双修饰激动剂（6NTet），其亲和力和活性进一步提升。晶体结构、分子动力学模拟和突变分析显示，6NTet的四唑尾部动态采样LRH-1配体结合口袋内两个不同的相互作用位点。其中一个位点对应于此前表征的、由磷脂配体和含羧酸酯的合成激动剂占据的区域（位点1），而第二个位点则代表此前未被识别的相互作用位点（位点2）。突变分析表明，两个位点均参与激动剂诱导的受体激活，而位点2还影响LRH-1的基础活性。总之，这些发现确立了四唑替换作为改进磷脂模拟型LRH-1激动剂的有效策略，并确定6NTet为有前景的先导化合物。新配体相互作用位点的发现进一步拓展了对LRH-1激活机制的理解，并为下一代激动剂设计提供了框架。
核受体（NRs）是配体调控的转录因子，通过调节对代谢和炎症稳态至关重要的基因表达程序，响应亲脂性代谢物。这些受体具有模块化结构，由DNA结合域（DBD）和配体结合域（LBD）经柔性连接区相连构成。配体结合促进共激活因子招募、染色质重塑及转录机器的激活。核受体家族成员之一肝受体同源物-1（LRH-1；NR5A2）主要表达于内胚层来源组织如肝脏和肠道，调控这些器官中的关键代谢和炎症通路。在肝脏中，LRH-1与FXR和SHP协同协调胆固醇、胆汁酸和葡萄糖稳态，还调控肝脏和肠道中的炎症基因表达、内质网应激及局部糖皮质激素生物合成。在肠道中，这些功能支持上皮更新和免疫平衡，将LRH-1失调与炎症性肠病联系起来。
LRH-1是一种磷脂（PL）感应核受体，以单体形式结合DNA以控制转录程序。虽然LRH-1的内源性配体未知，但其可结合多类PL。中链长度的磷脂酰胆碱在外源性给予时可激活该受体并调节共调节因子结合。在糖尿病小鼠模型中，1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DLPC）治疗以LRH-1依赖方式抑制参与脂肪生成的基因并缓解葡萄糖不耐受和肝脏脂肪变性。结构和生化研究表明，DLPC通过PL头部基团在LRH-1结合口袋入口附近形成极性接触，这对受体激活和变构共调节因子招募至关重要。由于DLPC等磷脂溶解性差且需高浓度才有效，研究人员致力于开发理化性质更优的合成小分子LRH-1调节剂。
最早的LRH-1激动剂包括GSK8470和RJW100，结合于配体结合口袋深部，通过保守的水介导相互作用网络激活受体，而不直接接触口袋入口处的PL配位残基。研究人员设计了一系列RJW100衍生物以接触PL结合位点。其中，通过10碳连接区将羧酸附加于RJW100骨架的化合物（"10CA"）最为有效，在报告基因实验中表现出优于RJW100的效力和活性。结构研究证实，10CA的羧酸与激活型PL所接触的残基（G421、Y516和K520）在口袋入口处形成氢键，且与Y516和K520的接触对结合和活性很重要。
研究人员此前证明，引入磺酰胺部分——一种能参与多重氢键相互作用的高极性官能团——可增强配体与LRH-1深部口袋极性网络的结合并调节受体激活。研究人员将含磺酰胺的核心与10CA骨架结合，后者向口袋入口延伸以重现内源性磷脂的相互作用。整合这些互补设计特征产生了6N10CA，其效力较早期类似物显著增强。
虽然向LRH-1激动剂添加羧酸可促进所需接触并增强LRH-1结合亲和力和激活，但含羧酸化合物在某些情况下可能表现出细胞摄取降低和代谢降解加速。羧酸在生理pH下电离导致主要呈阴离子状态，可限制膜通透性和细胞摄取。此外，这种阴离子特性可促进与有机阴离子转运多肽（OATPs）和有机阴离子转运体（OATs）等转运系统的相互作用，影响分布和药代动力学行为。因此，羧基的生物电子等排替换已成为微调配体-受体相互作用、增强功能效力、改善代谢稳定性并提升整体药代动力学和安全性的关键设计策略，而不显著改变整体结合模式。尽管许多羧酸酯生物电子等排体在生理条件下也保持负电荷，但电荷离域、亲脂性和几何形状的差异可改变这些基团在生物膜和蛋白质环境中的容纳方式。据此，研究人员设计并合成了10CA的生物电子等排类似物，以探索此类替换能否增强或维持LRH-1激活。将10CA羧酸酯替换为四唑等排体可保持高亲和力LRH-1结合，显著提高报告基因实验中的效力，并增强HepG2细胞中内源性LRH-1靶基因的诱导。将四唑尾部与磺酰胺部分结合以增强口袋深部相互作用的双修饰类似物（化合物6NTet）进一步提高了LRH-1结合亲和力和EC50。对LRH-1与四唑等排体及羧酸激动剂复合物的结构和全原子模拟分析揭示了共享的相互作用网络，其中6NTet的四唑尾部似乎在两个保守结合位点之间动态采样，提示此前未被识别的配体结合模式。这些研究确定四唑生物电子等排体为未来体内研究的有前景候选物，以评估LRH-1激活、药理功效和治疗潜力。
研究人员设计并合成了10CA的聚焦系列等排体，将羧酸替换为四唑（Tet）、酰胺（Am）、异羟肟酸（HA）、哌嗪（Pip）、氨基磺酸酯（Sul）或丝氨酸（Ser）部分。研究人员首先使用实验室开发的荧光偏振（FP）竞争实验评估配体与正构口袋的结合。所有等排体均以纳摩尔至微摩尔亲和力结合LRH-1（KiTet=23 nM，KiAm=290 nM，KiHA=1100 nM，KiPip=110 nM，KiSul=170 nM，KiSer=52 nM）。四唑等排体显示出最高亲和力（Ki = 23 nM），与10CA（Ki = 26 nM）几乎相同。与这些结合数据一致，10CA和Tet在热位移实验中赋予LRH-1 LBD最大稳定化，相对于溶剂对照分别使表观熔解温度提高6.6 °C和6.4 °C。其余类似物对LRH-1 LBD的热稳定化降低（低于5 °C）。研究人员接着使用SHP启动子上的荧光素酶报告基因实验评估这些替换对LRH-1依赖性转录活性的影响。与10CA相比，Tet、HA、Pip和Ser显示出更高的Emax。Tet（EC50 = 860 nM）和Sul（EC50 = 470 nM）比10CA更有效；然而Sul的Emax大幅降低。为考察这些差异如何转化为内源性基因调控，研究人员通过RT-qPCR在HepG2细胞（常用于评估LRH-1活性的肝来源细胞模型）中测量配体依赖性LRH-1靶基因调控。Tet对NR0B2（小异二聚体伴侣；SHP）和CYP7A1（胆固醇7α-羟化酶）产生最强劲的诱导，相对于DMSO对照驱动稳态mRNA水平的最大增加。总之，这些结果表明四唑替换增强细胞效力和LRH-1介导的靶基因激活，而不影响结合亲和力或配体诱导的LRH-1 LBD热稳定效应。
研究人员此前已证明，在RJW100的内型异构体（化合物6N）中引入磺酰胺部分可显著增强效力。将这一磺酰胺功能引入10CA（"6N10CA"）可改善结合亲和力，同时保留母体化合物的羧酸依赖性活性。在此基础上，研究人员将磺酰胺修饰与四唑等排体结合，生成双修饰类似物（"6NTet"）。添加磺酰胺改善了结合亲和力、LRH-1报告基因实验中的效力（EC50），并使LRH-1 LBD热稳定性较Tet提高约5 °C。6NTet还将NR0B2 mRNA水平提高到与Tet相同的程度。这些数据表明，磺酰胺部分可与四唑替换结合，进一步强化配体结合和受体稳定化，同时维持激动活性。
为确定四唑介导LRH-1激活的分子基础，研究人员解析了LRH-1 LBD与Tet及源自共激活因子转录中介因子2（TIF2）的肽段复合物的晶体结构。观察到配体核心、烷基尾和四唑头部基团分辨良好的电子密度，使得能够明确地将Tet置于配体结合口袋内。结构叠加显示，Tet采用与母体激动剂10CA高度相似的整体结合姿态，与其相当的结合亲和力和稳定化效应一致。如先前对RJW100和10CA所观察到的，Tet的羟基通过保守的水分子网络与口袋深部的极性残基相互作用。四唑头部基团向口袋入口延伸，与周围残基建立广泛接触。值得注意的是，K520的ε-氨基位于四唑规范氢键距离之外。结构比较提示，这一几何构型源于K520侧链的细微重定向，而非与四唑部分的位阻不相容。晶体在酸性条件（pH 4.6）下获得，这可能有利于四唑部分（pKa 4.5-4.9）质子化并减弱与K520的静电相互作用。这种质子化可能降低口袋入口处的电荷互补性，导致K520侧链偏离配体。LRH-1 LBD与10CA或Tet结合的全原子分子动力学（MD）模拟提示，四唑阴离子形成的接触是稳定的。模拟使用每种配体的去质子化形式——四唑阴离子和羧酸酯——以反映其在生理pH下的主要电离状态。与10CA相似，Tet在口袋入口形成强而持久的相互作用，同时通过直接和水介导的氢键维持与G421骨架和Y516侧链的关键接触。四唑部分还表现出与K520增强的相互作用；K520与四唑之间的离子相互作用在整个模拟中持续时间约为10CA相应相互作用的两倍，突显了四唑部分改善的相互作用。总之，这些观察提示Tet保留了10CA的核心结合架构，包括口袋入口附近的关键相互作用。
为确定6NTet介导LRH-1激活的结构基础，研究人员解析了6NTet与LRH-1 LBD结合的晶体结构。LRH-1 LBD-6NTet复合物在P43212空间群中结晶，不同于Tet、10CA和6N10CA晶体。观察到整个配体分辨良好的电子密度。磺酰胺部分与结合口袋深部的V406骨架酰胺和T352侧链形成氢键。额外的稳定化来自π–π堆积相互作用和与H390的水介导氢键。类似的相互作用此前在含磺酰胺的LRH-1激动剂结构中观察到。与Tet相反，6NTet的10碳四唑尾部采用不同的结合姿态。它不与LRH-1螺旋10中的残基相互作用（下称"位点1"），而是朝向螺旋3和β-转角/螺旋6区域，在那里分别与Q419和Q409形成直接和水介导的氢键（"位点2"）。结构叠加揭示了尾部相对于6N10CA和Tet的显著重定向，突显了6NTet中四唑部分相较于其他含四唑或羧酸尾部衍生物的独特定位。为评估这些结合差异如何影响配体结合口袋（LBP）的大小，研究人员比较了无配体（apo）和配体结合LRH-1结构的口袋体积。与先前观察一致，所有合成激动剂相对于apo受体均增加口袋体积。DLPC桥接口袋入口并加宽入口，比所有合成激动剂更大程度地扩展口袋。6NTet结构中的口袋体积是所有合成配体结构中最大的，包括Tet、10CA和6N10CA。这提示口袋扩展以容纳6NTet配体尾部的伸展构象。
为研究6N10CA和6NTet在晶体结构中所形成相互作用的重要性，研究人员进行了突变分析和全原子分子动力学模拟。首先，研究人员聚焦于两种化合物的磺酰胺与残基T352和H390形成的相互作用。研究人员生成H390和T352突变体，并使用荧光素酶报告基因实验评估配体响应性。配体结合缺陷型突变体A349F也作为对照纳入。突变体受体在无激动剂时显示出与野生型（WT）LRH-1相当的活性，但均表现出对6N10CA或6NTet激活的大幅降低。与这些功能数据一致，分子动力学模拟揭示了两种配体的磺酰胺基团与残基T352和H390之间持续且反复出现的接触。两种激动剂的磺酰胺在模拟中形成的其他稳定接触见于R393和V406。虽然磺酰胺主要与V406形成直接氢键，但与T352、H390和R393的相互作用经常由配体结合口袋内保守水分子介导。
6N10CA和6NTet的10碳尾部在晶体结构中采用非常不同的取向。尽管结晶条件和晶体堆积的差异可能导致这些位置差异，但两种结构中配体尾部均分辨良好并形成特异性相互作用。接触6NTet尾部的残基在物种间保守，支持其可能具有功能重要性的观点。这些观察提出了6NTet中观察到的替代尾部姿态促成受体调节并可能反映独特配体结合机制的可能性。为研究这一点，研究人员对晶体结构中接触羧酸酯（位点1）或四唑（位点2）尾部的残基进行了突变分析。在位点1，单K520A突变相对于WT受体对LRH-1基础活性或LRH-1荧光素酶报告基因实验中的配体响应性影响极小。然而，K520A/Y516F双突变体显示出对6N10CA和6NTet响应性的显著丧失，提示四唑阴离子可能与K520和Y516相互作用。K520A/Y516F双突变体相对于WT LRH-1还显示出略微降低的基础活性。
位点2关键残基（T341、Q409和Q419）的突变显著降低基础受体活性，并减弱对6NTet和6N10CA的响应性，提示该区域在配体依赖性和基础受体激活中均起关键作用。对全部已发表LRH-1 LBD结构（n = 26）的分析揭示，有五个结构在残基Q409附近的位点2裂隙中有分子结合。值得注意的是，这些均为PL结合结构。例如，LRH-1-DLPC结构描绘了一个PEG分子结合于位点2。与更灵活的四唑部分不同，磷脂相对刚性，不在替代结合位点之间采样，可能使该次级位点对其他小分子保持可及。
分子动力学模拟揭示，四唑尾部最初占据位点2，与Q419和Q409相互作用，随后在三次模拟中的两次过程中重新定向朝向位点1，与K520和Y516相互作用。在模拟中等间距帧中测量四唑与Q409（位点2）和Y516（位点1）之间的距离，揭示了两个主要状态，表明在替代姿态之间的动态采样。相反，对LRH-1–6N10CA复合物的类似分析显示，羧酸大部分局限于单个位点（位点1）。总之，这些发现表明6NTet和6N10CA参与共同的相互作用网络，而四唑尾部动态采样受体口袋内两个不同的位点，两者似乎均促成LRH-1活性。
LRH-1的PL配体通过其极性头部基团接触配体结合口袋入口处的残基。相反，早期合成激动剂主要与口袋深部残基相互作用，未能重现这些PL介导的接触。修饰合成激动剂骨架以接触PL接触残基可显著改善效力和功效。这些化合物中最活跃者采用羧酸部分接触口袋入口残基。在此，研究人员探索了替代极性等排体，发现四唑替换保持了LRH-1 LBD结合和稳定化，同时相对于10CA提高了报告基因实验中的效力并增强了HepG2细胞中LRH-1靶基因表达。
四唑是成熟的羧酸等排体，存在于20多种FDA批准药物中。四唑在大小上与羧酸接近，由于电荷离域在生理pH下电离（pKa：羧酸4.2–4.4；四唑4.5–4.9）。这也赋予所得四唑阴离子进行π–π相互作用的能力。此外，由于四唑不存在于自然界，其对许多代谢降解途径具有抗性，通常导致相对于羧酸的作用持续时间延长。据报道，四唑阴离子的亲脂性约为羧酸酯的十倍，这一特性通常与改善的细胞摄取相关。这可能解释为何Tet在细胞报告基因实验中比10CA有效近四倍，并增强HepG2细胞中LRH-1靶基因表达，尽管两者具有几乎相同的结合亲和力。然而，Lassalas等最近的研究发现四唑比羧酸细胞通透性更低，可能由于四唑阴离子相对于羧酸酯增加的溶剂化能力。如果Tet并不比10CA更具细胞通透性，则增强的效力可能是与PL感应残基增强氢键的结果。这将与LRH-1-Tet复合物的MD模拟一致，后者提示四唑阴离子由于额外两个氢键受体原子能够同时与G421、Y516和K520结合，因而比10CA具有更强的氢键能力。
基于这些观察，研究人员试图通过引入磺酰胺部分进一步增强配体功效，该部分此前已被证明可显著改善相关分子的效力，并与10CA衍生物中羧酸介导的功效相容。所得化合物6NTet相对于Tet显示出改善的亲和力和效力，同时维持报告基因实验和qPCR中的活性。结构、突变和MD分析表明，含四唑阴离子和羧酸酯的配体在口袋内部参与基本共享的相互作用网络，6NTet的四唑尾部在两个替代结合姿态之间动态采样。LRH-1 LBD-6NTet在P43212空间群中结晶，不同于LRH-1 LBD-6N10CA（P3212）。对先前结构的再分析显示，P43212空间群捕获了这一替代构象（位点2），而P3212结构（如6N10CA）一致保留规范的位点1姿态。MD模拟支持这一区别，因为以配体尾部在位点1开始的模拟保持稳定，而位点2中的尾部要么停留要么过渡到位点1。在功能上，位点2残基的突变降低基础活性并减弱6NTet和6N10CA的配体依赖性激活。由于位点2关键残基的突变即使在无外源配体时也降低受体激活，位点2可能在内源性配体识别中发挥作用。在先前与磷脂（如DLPC）结合的LRH-1结构中，该区域（位点2）被PEG等小分子占据。与更灵活的四唑部分不同，磷脂相对刚性，不在替代结合位点之间采样。在此类情况下，第二位点可能对其他小分子保持可及。这些观察进一步支持LRH-1配体结合口袋内存在替代结合位点。
值得注意的是，协调极性尾部相互作用的残基（Q419、Q409、K520和Y516）在灵长类以及牛和斑马鱼中高度保守，表明口袋内配体相容静电环境的保留。相反，在啮齿类LRH-1中观察到细微替换，可能改变局部口袋环境并影响配体效力或功效，提示保守的结合架构伴随物种依赖的激动剂稳定化调节。
总之，研究人员的发现确立四唑作为10CA羧酸的有效生物电子等排替换，能够接触LRH-1口袋入口处的磷脂结合残基，并强调口袋入口相互作用在塑造NR5A激动剂功效中的重要性。用四唑替换羧酸保持高亲和力结合，同时增强受体稳定化和转录输出，与增加的氢键能力和口袋入口处的动态相互作用一致。杂合化合物6NTet的行为进一步提示，将四唑尾部相互作用与互补的深部口袋接触相结合可增强激动剂性能。总之，这些结果表明四唑生物电子等排类似物代表未来LRH-1激活体内研究的有前景候选物，便于评估药理功效、靶标结合和治疗潜力。
