《JHEP Reports》：Single-cell profiling reveals monocyte mitochondrial dysfunction in patients with cirrhosis progressing to acute-on-chronic liver failure
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**背景与目的**：肝硬化急性失代偿（acute decompensation, AD）患者发生慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure, ACLF）的风险很高，ACLF是一种以多器官衰竭和高短期死亡率为特征的综合征。目前缺
**背景与目的**：肝硬化急性失代偿（acute decompensation, AD）患者发生慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure, ACLF）的风险很高，ACLF是一种以多器官衰竭和高短期死亡率为特征的综合征。目前缺乏针对驱动AD向ACLF转变的细胞机制的前瞻性研究。本研究旨在明确入院时外周免疫细胞亚群能否预测AD向ACLF的进展，并阐明其潜在分子机制。
**方法**：研究人员在欧洲五个中心前瞻性纳入63例AD患者和15例健康供者，并进行90天随访。对16例具有不同疾病轨迹的患者和4例对照的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。
**结果**：向ACLF的进展与经典单核细胞（classical monocytes）的扩增相关，尤其是亚群“C2”，该亚群特异性表现为能量代谢受损，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）水平降低（p<0.001）。由C2衍生的18个基因特征在两个大型国际全血队列（PREDICT, n=689; ACLARA, n=521）中富集，尤其是在合并细菌感染、进展为ACLF以及死亡的患者中富集（p<0.001）。在独立AD队列中通过呼吸测定法进行的功能验证证实，pre-ACLF患者的单核细胞Complex IV依赖性耗氧量呈下降趋势（p<0.05）。
**结论**：研究人员识别并验证了一个具有能量代谢缺陷的独特单核细胞亚群，该亚群见于预后不良的AD患者，支持单核细胞生物能量学功能障碍与ACLF发展之间存在关联。
**影响与意义**：驱动急性失代偿（AD）向慢加急性肝衰竭（ACLF）进展的细胞机制仍知之甚少，限制了有效治疗干预策略的开发。通过整合前瞻性单细胞转录组学、功能性生物能量学分析以及独立多中心队列的验证，研究人员识别出一个以氧化磷酸化受损为特征、与后续ACLF发展相关的独特单核细胞亚群。这些发现对临床医生和研究人员具有重要意义，因为它们提示免疫-代谢功能障碍在显性ACLF发生之前就已出现，并可能促进疾病进展。虽然还需要进一步的机制研究和前瞻性验证研究，本研究结果为探索单核细胞生物能量学作为失代偿期肝硬化患者潜在治疗靶点提供了框架。
**论文解读：单核细胞线粒体功能障碍与肝硬化失代偿向慢加急性肝衰竭进展的关联**
**一、研究背景与科学问题**
肝硬化急性失代偿（acute decompensation, AD）是肝硬化患者住院的最常见原因，以腹水、肝性脑病或消化道出血等临床并发症为特征。AD患者进展为慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure, ACLF）的风险显著升高，ACLF以肝功能急性恶化和一个或多个肝外器官衰竭为特征，短期死亡率在15%至80%之间。AD向ACLF转变是一个由全身炎症、免疫功能障碍和器官串扰驱动的动态多因素过程。尽管已有研究揭示了全身炎症在ACLF发病中的核心作用，包括促炎细胞因子升高、Toll样受体信号通路激活以及肠道屏障功能障碍导致的微生物产物易位，但个体免疫细胞亚群在疾病进展中的相对贡献仍不明确。特别是，哪些功能性免疫细胞状态先于并预测AD患者ACLF的发生，目前尚不清楚。虽然单细胞RNA测序（scRNA-seq）已被应用于已确诊ACLF的患者，揭示了单核细胞和T细胞中独特的免疫代谢改变，但这些研究聚焦于已完成向ACLF转变的患者，缺乏对随后发展为ACLF的AD患者外周免疫细胞改变的前瞻性高分辨率分析。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员开展了一项前瞻性多中心研究，于2020年10月至2021年7月在欧洲五个中心（巴黎、法兰克福、亚琛、博洛尼亚和都灵）纳入63例AD患者和15例健康对照。所有患者在入院72小时内完成血样采集，并随访90天，记录因AD再入院、ACLF发生及临床结局。根据临床轨迹将患者分为稳定失代偿期肝硬化（stable decompensated cirrhosis, SDC）、不稳定失代偿期肝硬化（unstable decompensated cirrhosis, UDC）和pre-ACLF（28天内发生ACLF）。关键技术方法包括：对入选患者外周血单个核细胞（PBMCs）进行CITE-seq（单细胞转录组与表面蛋白同时测序）分析；对同一队列进行配对全血转录组测序；在PREDICT（n=689）和ACLARA（n=521）两个大型国际独立前瞻性队列中进行全血转录组验证；以及在独立单中心队列中利用Seahorse细胞外通量分析仪进行线粒体呼吸功能的呼吸测定法（respirometry）验证。CITE-seq分析队列包含16例患者（6例SDC、6例UDC、4例pre-ACLF）和4例健康对照，共获得130,846个细胞，中位基因数1,632个/细胞。
**三、主要研究结果**
**1. 循环经典单核细胞增加与ACLF发展相关**
无监督聚类识别出11种免疫细胞群。AD患者中经典单核细胞显著增加，pre-ACLF患者呈现最高倍数变化。经典单核细胞在所有对比中展现出最多差异表达基因（DEGs），直接比较pre-ACLF与SDC、UDC进一步证实经典单核细胞转录变化最为显著，表明外周免疫细胞景观发生了以经典单核细胞选择性扩增和转录激活为特征的实质性重塑。
**2. 识别与AD进展相关的经典单核细胞亚群**
对经典单核细胞进行亚聚类分析，识别出C0、C1、C2三个亚群，沿Monocle3推断的拟时间轨迹排列，C1为C0与C2之间的中间转录状态。C2在pre-ACLF患者中选择性增加，pre-ACLF组内C2比例越高，与ACLF发生潜伏期越短相关。
**3. C2单核细胞具有免疫调节和代谢抑制表型**
与C0相比，C2单核细胞CD14、HLA-DR编码基因（HLA-DRA、HLA-DRB1）、S100家族成员及溶菌酶（LYZ）表达降低，而MERTK、VCAN、IRAK3、HIF1A、TLR2等免疫调节和炎症信号基因上调。差异表达分析显示，C2中参与细胞能量代谢的基因显著下调，包括多个ATP合酶（Complex V）和细胞色素c氧化酶（Complex IV）亚基。C2亚群不表达FCGR3A（CD16），排除其中间型或非经典单核细胞属性，代表CD16?经典单核细胞区内一种独特的转录状态。
**4. C2单核细胞以线粒体呼吸深度抑制为特征**
基因集富集分析（GSEA）显示氧化磷酸化（OXPHOS）是C2单核细胞中负富集最显著的通路，OXPHOS模块评分在亚群间呈梯度下降（C0 > C1 > C2）。按临床分组分层后，C2在疾病各阶段均呈现最低OXPHOS活性，且该降低具有C2亚群特异性，表明C2单核细胞存在不依赖于疾病背景的线粒体呼吸稳健抑制。
**5. C2基因特征向全血转录组的转化与独立队列验证**
基于单细胞数据定义了96个C2特征基因，在全血RNA-seq中检测到94个，经阈值筛选后确定18个基因构成全血C2特征：SLC11A1、NAMPT、SMAP2、CD55、ACSL1、NEAT1、DLEU2、IRAK3、KYNU、TBXAS1、FKBP5、NUMB、PHF21A、AOAH、ZFAND3、LYN、SLCO3A1、PTEN。在两个大型独立前瞻性队列（PREDICT和ACLARA）中，C2特征活性与总胆红素、MELD和CLIF-C AD评分呈显著正相关，在pre-ACLF患者和非存活者中显著升高，且与细菌感染相关。多因素logistic回归显示，经MELD校正后C2特征与ACLF独立相关。Kaplan-Meier分析表明，入院时C2特征活性高的患者ACLF无进展概率和总生存率均显著降低。
**6. 功能验证证实进展为ACLF的AD患者Complex IV活性受损**
在独立的前瞻性单中心队列（12例AD患者，其中8例SDC/UDC、4例pre-ACLF）中，从入院全血样本分离CD14?经典单核细胞，利用Seahorse细胞外通量分析仪进行冷冻样本呼吸测定（RIFS）。尽管分析的是总CD14?单核细胞群，pre-ACLF患者Complex IV依赖性耗氧率（OCR）较SDC和UDC患者呈进行性下降，而Complex I和II驱动的最大呼吸能力无显著差异，该功能性发现与C2亚群转录水平的Complex IV下调一致。
**四、讨论与结论**
本研究采用前瞻性设计，在AD阶段而非ACLF确立后识别出先于ACLF发生的免疫改变。C2单核细胞与既往描述的M-MDSCs、内毒素耐受单核细胞及CD16?单核细胞亚群均不对应，代表一种此前未描述的、与AD进展和后续ACLF发展相关的独特单核细胞状态。C2亚群表现出免疫调节表型和抗菌防御受损特征，与其在细菌感染患者中富集的临床观察一致，提示早期免疫功能障碍可能增加细菌感染易感性——这是ACLF的关键诱发事件。OXPHOS抑制是C2最显著的转录特征，功能呼吸测定证实Complex IV依赖性呼吸受损，且该缺陷在AD向ACLF进展的较早期阶段已存在，支持线粒体功能障碍连续体模型。研究局限性包括单细胞发现队列样本量有限、PBMC设计无法评估中性粒细胞、全血RNA-seq验证可能受细胞组成差异影响。研究结论：本研究识别出一个此前未知的经典单核细胞亚群，该亚群与AD向ACLF的进展相关，以免疫调节特征和显著生物能量学功能障碍为特征，可能增加细菌感染易感性并促进疾病进展。研究结果为开展转化研究提供了依据，即免疫-代谢特征能否改善AD患者的风险分层，以及调节单核细胞生物能量学是否可作为预防ACLF的潜在治疗策略。
