《JID Innovations》：Desmoglein-3 Deficiency Restricts Cutaneous HSV-1 Infection by Acantholysis-Mediated Disruption of Cell-to-Cell Transmission
编辑推荐：
表皮完整性的破坏通常被认为促进病毒通过皮肤屏障侵入。然而，由于1型单纯疱疹病毒（HSV-1）主要通过细胞间传播扩散，角质形成细胞黏附受损反而可能限制病毒播散。研究人员探讨了desmoglein-3（Dsg3）缺失是否改变对HSV-1感染的易感性。将HSV-1接
表皮完整性的破坏通常被认为促进病毒通过皮肤屏障侵入。然而，由于1型单纯疱疹病毒（HSV-1）主要通过细胞间传播扩散，角质形成细胞黏附受损反而可能限制病毒播散。研究人员探讨了desmoglein-3（Dsg3）缺失是否改变对HSV-1感染的易感性。将HSV-1接种于Dsg3基因敲除（Dsg3KO）和野生型（WT）C57BL/6小鼠经胶带剥离的皮肤上。在体内、离体和培养的角质形成细胞中评估临床严重程度、病毒载量、组织学变化和病毒播散。Dsg3KO-B6小鼠与WT-B6小鼠相比，皮肤病变显著较轻且HSV-1 DNA载量较低。组织学分析显示感染后的Dsg3KO表皮中出现明显的TUNEL阳性棘层松解，HSV-1感染的角质形成细胞局限于棘层松解区域，从而限制了向周围表皮的扩散。局部给予致病性抗Dsg3抗体AK23可重现该表型，降低病变严重程度、病毒载量和表皮内病毒播散。离体表皮感染实验显示Dsg3KO表皮中HSV-1阳性病灶的扩增延迟且TUNEL阳性棘层松解细胞增多。培养的Dsg3KO角质形成细胞同样表现出HSV-1细胞间传播受损。这些效应独立于nectin-1表达和免疫细胞群。Dsg3缺失通过促进棘层松解和细胞凋亡，从而中断表皮内高效的病毒传播，发挥"表皮分离屏障"作用，保护宿主免受HSV-1感染。
研究背景方面，表皮屏障完整性通常被认为是防止病原体和环境抗原入侵的必要条件。与此概念一致，表皮屏障功能缺陷（如filaggrin突变所致）使特应性皮炎（AD）患者易患疱疹性湿疹，即HSV感染的严重播散形式。这些观察支持了表皮屏障破坏促进HSV侵入和疾病进展的主流观点。HSV-1初次感染后主要通过直接的细胞间传播在上皮组织内高效扩散，这被认为是人皮肤和黏膜中病毒播散的主要途径。然而，尽管细胞间传播在HSV致病机制中至关重要，限制病毒在表皮内播散的关键宿主因素仍知之甚少。寻常型天疱疮（PV）是一种以角质形成细胞黏附丧失为特征的自身免疫性大疱性疾病，主要由针对desmoglein-3（Dsg3）的自身抗体引起。由于PV与上皮完整性受损相关，曾有人提出该疾病可能通过促进病毒更容易地进入皮肤或黏膜表面而利于HSV重叠感染。事实上，HSV常从PV早期口腔病变中分离出来，导致关于其是否参与PV发病机制的长期争论。基于上皮屏障缺陷增强病毒易感性的概念，研究人员最初预期在Dsg3缺失条件下HSV感染会更易扩散。然而，与AD不同，PV通常不与疱疹性湿疹或其他形式的播散性HSV感染相关。这一临床观察提示，角质形成细胞黏附受损可能对HSV传播产生意想不到的抑制作用。由于HSV-1严重依赖直接的细胞间传播，细胞间黏附的破坏可能干扰病毒在相邻角质形成细胞间的扩散，从而尽管上皮完整性受损却限制感染。因此，上皮屏障功能障碍和细胞间传播受损可能对HSV致病机制产生相反的作用，棘层松解对HSV感染的净影响尚不清楚。此外，棘层松解偶尔继发于HSV和水痘-带状疱疹病毒感染，尽管其生物学意义尚不明确。棘层松解是通过破坏组织完整性促进病毒播散，还是作为限制细胞间传播的宿主防御机制，尚未确定。为解决这些问题，研究人员研究了Dsg3缺陷小鼠对经皮HSV-1接种的易感性，检验了Dsg3缺失导致的棘层松解通过破坏病毒细胞间传播来限制HSV扩散的假说。
研究人员开展的研究及主要结论：研究人员利用Dsg3KO-B6小鼠和野生型C57BL/6J小鼠，采用胶带剥离后经皮接种HSV-1的模型，结合体内、离体和体外实验，系统评估了Dsg3缺失对HSV-1感染的影响。研究发现Dsg3KO-B6小鼠皮肤病变显著较轻、HSV-1 DNA载量较低、病毒在表皮内播散受限，但DRG中病毒载量与WT无差异。棘层松解区域中HSV-1感染的角质形成细胞呈TUNEL阳性并局限于该区域，限制了向周围非棘层松解区域的水平传播。局部注射致病性抗Dsg3抗体AK23可重现该表型。离体和体外实验进一步证实Dsg3KO角质形成细胞中HSV-1细胞间传播受损。这些效应独立于nectin-1表达和免疫细胞群。研究结论表明，Dsg3缺失通过促进棘层松解和凋亡，破坏表皮内高效的病毒传播，发挥"表皮分离屏障"作用保护宿主免受HSV-1感染。这一发现具有重要意义：颠覆了表皮屏障破坏必然促进HSV感染的既有观念，揭示了棘层松解作为宿主防御机制的新功能，并为理解PV患者不易发生播散性HSV感染提供了机制解释。
关键技术方法概述：研究人员主要采用了以下技术方法：（1）Dsg3KO-B6小鼠（由Keio大学医学院Amagai教授提供）和WT C57BL/6J小鼠（购自The Jackson Laboratory Japan）的体内HSV-1感染模型，采用胶带剥离和针刺划痕两种方式破坏皮肤屏障后经皮接种HSV-1（7401H株，3.8×10? pfu）；（2）局部经皮给予致病性抗Dsg3单克隆抗体AK23（40 μg/只）；（3）组织学分析包括HE染色、免疫组化（ICP0、Langerin、CD4、CD8、CD20、CD56、CD103）和TUNEL凋亡检测；（4）qPCR定量HSV-1 DNA载量；（5）离体表皮片HSV-1-GFP（YK333株）感染活细胞成像；（6）体外培养角质形成细胞感染实验及病毒空斑试验；（7）透射电子显微镜观察棘层松解与病毒颗粒释放的时序关系；（8）Western blot检测nectin-1、E-cadherin和desmocollin-1表达。
研究结果方面：（1）Dsg3缺失减轻皮肤HSV-1感染和病毒持续性——通过比较划痕和胶带剥离两种接种方式，发现胶带剥离更高效地建立HSV-1感染，Dsg3KO-B6小鼠在接种后第4天皮肤病变面积显著小于WT-B6小鼠，HSV-1 DNA载量持续较低且清除更早，但DRG中病毒载量无差异，表明Dsg3缺失选择性限制皮肤中HSV-1复制而不影响向DRG的播散。（2）棘层松解导致凋亡并限制HSV-1感染——通过组织学分类分析发现，Dsg3KO-B6小鼠接种后棘层松解显著增加，ICP0阳性细胞主要局限于结痂区和棘层松解区，棘层松解区中ICP0阳性细胞分别有79.8%（WT）和96.5%（Dsg3KO）为TUNEL阳性，而非棘层松解区ICP0阳性细胞为TUNEL阴性，表明TUNEL阳性棘层松解限制HSV-1在表皮内的水平传播。（3）局部给予抗Dsg3抗体对HSV-1诱导皮肤病变严重程度的影响——通过AK23局部注射实验发现，AK23处理WT-B6小鼠可重现Dsg3KO表型，棘层松解细胞增多、ICP0阳性细胞减少、皮肤评分和病变面积显著降低，证实Dsg3抗体可重现Dsg3缺失的效应。（4）Dsg3KO-B6小鼠的免疫细胞应答和nectin-1表达——通过免疫组化和Western blot分析发现，HSV-1感染后WT和Dsg3KO-B6小鼠皮肤中CD4?、CD8?、CD56?、CD103?和Langerin?细胞数量变化无显著差异，nectin-1、E-cadherin和desmocollin-1表达水平相当，表明上述效应独立于免疫细胞和病毒受体表达。（5）离体小鼠表皮片HSV-1感染模型——通过表皮片GFP-HSV-1感染活细胞成像发现，感染24和48小时后GFP阳性菌落数无差异（表明病毒进入效率相似），但WT中GFP阳性细胞数和菌落面积增长更快，Dsg3KO表皮片中棘层松解细胞增多且多为TUNEL阳性，证实Dsg3缺失延迟HSV-1细胞间传播。（6）培养角质形成细胞中上皮完整性受损对HSV-1细胞间传播的影响——通过体外感染实验发现，Dsg3KO和AK23处理WT角质形成细胞中棘层松解细胞增多、HSV-1阳性细胞比例降低、释放的感染性病毒颗粒显著减少（Dsg3KO：9.1×10? PFU/mL；AK23处理：1.0×10? PFU/mL；未处理WT：4.2×10? PFU/mL），表明Dsg3促进病毒向邻近角质形成细胞传播。（7）病毒颗粒释放发生于棘层松解形成之后——通过BFM和电镜观察发现，感染后6小时28.5%未分化角质形成细胞出现棘层松解改变（模拟感染为4.6%），但电镜未检测到病毒颗粒释放；感染后8小时首次在细胞间隙检测到新复制的病毒颗粒，从时间顺序上证实棘层松解先于病毒颗粒产生。
讨论部分总结：表皮屏障完整性被认为是防止病毒等有害物质穿透的必要条件，tight junction蛋白和filaggrin突变可能增强HSV感染易感性。然而，限制HSV感染的控制因素知识仍然有限。研究人员最初聚焦于Dsg3KO-B6小鼠，虽然Dsg3缺失未改变表皮桥粒结构且WT与Dsg3KO角质形成细胞对HSV-1易感性无差异，但减弱的黏附导致表皮脆弱性和棘层松解。鉴于Dsg3在基底层和棘层均有表达，Dsg3缺失预期可限制HSV-1从基底层向棘层的侵入和传播以及基底层细胞内的传播。结合此前在PV患者中观察到HSV DNA在抗Dsg3抗体滴度显著升高之前即可检测到的现象，研究人员推测HSV-1感染后产生的抗Dsg3抗体可能作为限制表皮内HSV-1进一步细胞间传播的自我保护机制。Dsg3缺失条件下ICP0表达细胞主要在棘层松解区内检测到，而在非棘层松解区几乎检测不到，提示维持基底与棘层角质形成细胞间的物理分离可能有助于限制HSV-1侵入。研究人员将此概念类比为"社交距离"原则，提出"表皮分离屏障"概念，即症状出现时维持角质形成细胞间早期物理分离可限制HSV-1感染的进一步传播。因此，抗Dsg3抗体虽然在PV病理中具有负面影响，但在早期阶段可能对HSV-1侵入具有保护作用。这一解释与先前认为上皮完整性破坏促进HSV-1侵入的观点形成对比。Dsg3缺失可能不像AD中疱疹性湿疹那样促进HSV-1播散，而是限制HSV-1的细胞间传播而非促进病毒进入。棘层松解长期被视为疾病后果，但其病理功能尚不清楚。尽管存在持续性DRG感染证据，Dsg3KO-B6小鼠中HSV-1播散更受限且病毒清除更强。鉴于ICP0表达细胞主要在棘层松解区尤其是棘层松解细胞中检测到，而Dsg3KO-B6小鼠非棘层松解区角质形成细胞基本为ICP0阴性，棘层松解在HSV感染背景下可能隔离和排除感染细胞。由于棘层松解可先于病毒颗粒产生，棘层松解抑制HSV-1细胞间传播得以明确。此外，棘层松解可能在清除凋亡和濒死细胞、防止进一步病毒感染中发挥稳态作用。因此，棘层松解不应仅被视为HSV-1感染的诊断线索，它可能有助于减轻皮肤病变严重程度。研究局限性包括：缺乏更接近生殖器疱疹的模型评估HSV-1细胞间传播；未确定Dsg1表达增加是否可代偿Dsg3缺失从而保护免受HSV感染；Dsg3可能间接结合其他细胞连接蛋白形成"表皮分离屏障"。研究结论翻译：总之，研究人员发现Dsg3缺失似乎至少部分通过诱导棘层松解而不涉及免疫细胞来提供对HSV-1感染的保护。研究人员提出Dsg3缺失在HSV感染部位诱导保护机制。Dsg3缺失对HSV-1感染的这种保护作用也可能解释为什么与AD患者不同，许多PV患者尽管表皮脆弱却不发生播散性皮肤HSV-1感染。
