《Journal of Advanced Research》：The ABC transporter CsABCI17 mediates the reduction of fluoride accumulation in tea leaves under exogenous melatonin treatment
编辑推荐：
氟是自然环境中重要的微量元素之一，主要来源于地球化学循环和人类工业生产活动，以氟离子及多种氟络合物的形式存在于土壤、空气、水以及动植物组织中。氟不是植物必需元素，可通过根系和叶片从环境中吸收并在植物组织内积累，对植物具有双重影响：低浓度下对植物生长发育和正常生
氟是自然环境中重要的微量元素之一，主要来源于地球化学循环和人类工业生产活动，以氟离子及多种氟络合物的形式存在于土壤、空气、水以及动植物组织中。氟不是植物必需元素，可通过根系和叶片从环境中吸收并在植物组织内积累，对植物具有双重影响：低浓度下对植物生长发育和正常生理代谢无明显不利影响，而高浓度氟可诱导胁迫响应，导致生长受抑和代谢过程受损。目前植物氟研究主要集中在吸收、转运、转化和耐受机制方面。茶树（Camellia sinensis）作为氟超积累植物，是研究植物氟相关过程的优良模式材料。研究表明茶树对氟具有选择性吸收，不同品种间吸收和积累能力差异显著。研究人员已对茶树各组织（如根、茎、叶）中氟的分布模式及氟积累机制进行了研究。适量氟可促进茶树生长、提高产量和品质，而过量氟则产生毒害，影响植物健康及茶叶产品安全与品质。在耐受机制方面，已鉴定出两个氟转运蛋白CsFEX1（Fluoride export gene 1）和CsFEX2（Fluoride export gene 2），其中CsFEX2通过介导氟离子外排增强低氟品种的耐氟性。氟胁迫下，ABC转运蛋白CsABCB9（ABC transporter B family member 9）作为氟外排转运蛋白发挥作用，减轻叶片损伤并改善叶绿体活性。近期研究表明，质膜定位的CsALMT6（Aluminum-activated malate transporters 6）和CsALMT14（Aluminum-activated malate transporters 14）通过氟外排及调节苹果酸和柠檬酸代谢相关基因参与耐氟。此外，根系特异性CsNPF2.3（Nitrate transporter 1/Peptide transporter family 2.3）参与茶树氟吸收和转运。尽管茶树可在高氟环境中生长，但此类条件对茶叶产量和品质均产生负面影响。茶作为全球消费量仅次于水的饮料，是氟经食物链进入人体的主要途径。长期饮用高氟鲜叶加工的茶叶可导致饮茶型氟中毒，如氟牙症和氟骨症，构成严重健康风险。因此，制定有效策略降低茶叶氟积累对保障茶叶产品安全与品质至关重要。目前已有若干降低茶叶氟含量的策略，但多数降氟方法因需大量经济和劳动力投入而实用性受限，难以大规模推广。因此，寻找在实际茶叶生产中具有较强应用和推广潜力的降氟措施十分重要。褪黑素作为一种存在于动物和植物中的广泛植物生长调节剂，在调控植物对土壤离子和重金属胁迫响应中发挥关键作用。褪黑素以低成本、环境友好和安全性著称，具有较高的农业应用潜力。茶树中褪黑素降氟效果的研究主要集中于生理生化机制，即通过调控抗氧化防御系统和次生代谢缓解氟胁迫。研究发现外源褪黑素处理可通过促进茶花青素生物合成增强茶树抗氟性，并降低成熟叶氟含量。然而，外源褪黑素处理降低茶树氟含量的机制尚未阐明。本研究发现外源食品级褪黑素处理显著降低茶树叶片氟积累，并进一步分析了外源褪黑素处理降低茶叶氟含量的方式。通过转录组测序及与氟含量的相关性分析，鉴定出一个新型ABC转运蛋白CsABCI17（ABC transporter I family member 17）与氟转运相关。通过基于大肠杆菌的转运实验、体外ATPase活性实验以及拟南芥过表达和茶树过表达与沉默的体内实验进一步验证了其功能。此外，CsABCI17在氟转运中的作用在多个茶树品种中保守。本研究鉴定了一个先前未表征的氟转运蛋白，揭示了褪黑素调控氟转运的机制，为降低茶树氟水平提供了新策略，对提高茶叶品质和保障食品安全具有重要意义，同时为改善作物安全提供了一种安全实用的方法，对可持续农业具有直接应用潜力。
研究背景方面，氟作为非必需元素在植物体内积累具有双重效应，茶树作为氟超积累植物是理想研究模型，但高氟环境损害茶叶产量与品质，且茶叶是人体氟摄入的主要食物链途径，长期饮用高氟茶可引发饮茶型氟中毒。现有降氟策略如低氟品种选育、加工工艺改进和栽培管理优化等均存在周期长、成本高或影响土壤性质等局限，亟需开发应用推广潜力强的降氟措施。褪黑素作为低成本、环境友好的植物生长调节剂在调控离子胁迫中具有潜力，但其降低茶树氟含量的机制尚未阐明。研究人员以‘中茶108’（低氟积累优质品种）为主要材料，辅以‘福选9号’（低氟品种）、‘金萱’（中氟品种）和‘雅士香’（高氟品种）验证通用性，采用一年生扦插苗（广东潮州大荣茶苗基地提供），经清水和梯度营养液预培养后开展褪黑素和NaF处理实验。研究得出以下结论：外源食品级褪黑素（最优浓度100 μM）显著降低茶树叶片水溶性氟含量，且在多个品种中验证一致；鉴定出新型ABC转运蛋白CsABCI17参与氟转运，褪黑素通过下调CsABCI17转录抑制氟从茎向叶的转运，从而降低叶片氟含量；提出了CsABCI17参与外源褪黑素调控茶树氟含量降低的调控模型。该研究揭示了外源食品级褪黑素抑制茶树氟积累的分子机制，为开发基于褪黑素的新型植物生长调节剂保障茶叶品质与安全奠定了理论基础，其环境友好性和广泛品种适用性为规模化应用提供了技术依据。论文发表在《Journal of Advanced Research》。
在技术方法上，研究人员主要采用以下关键技术：转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台）结合KEGG富集分析和加权基因共表达分析筛选差异表达基因；qRT-PCR检测基因表达水平；RNA原位杂交（RNA in situ hybridization）定位CsABCI17在叶柄中的组织特异性表达；亚细胞定位分析（拟南芥原生质体转化结合激光共聚焦显微镜观察）；基于大肠杆菌的氟转运功能鉴定（氟离子选择性电极测定胞内氟含量及梯度稀释生长实验）；ATPase活性比色法测定CsABCI17对氟的响应；拟南芥过表达（花序浸染法结合潮霉素筛选获得T3代纯合株系）及茶树瞬时过表达（根癌农杆菌GV3101注射法）和瞬时沉默（T7 RNAi体外转录dsRNA注射法）实验；Western blotting检测蛋白表达；氟离子选择性电极法（参照NY/T 838–2004标准）测定氟含量及各形态氟连续梯度提取测定。样本队列来源为广东潮州大荣茶苗基地提供的一年生扦插苗。
研究结果如下：
外源食品级褪黑素处理显著降低茶树叶片氟积累。通过室内控制实验以‘中茶108’为材料，在不同浓度褪黑素（0、50、100、200 μM）结合100 mg/L NaF胁迫下测定氟含量，发现外源褪黑素显著降低地上部（茎+叶）氟含量，100 μM处理效果最显著（约降低50%），且主要降低水溶性氟含量。在‘福选9号’‘金萱’‘雅士香’三个品种中验证，外源褪黑素均显著降低地上部氟积累而不影响根系氟含量，证实其降氟效果具有品种通用性。
转录关联分析鉴定介导褪黑素降氟的靶基因。通过对100 μM褪黑素结合100 mg/L NaF处理6 d后的地上部样本进行转录组测序，KEGG富集分析显示差异表达基因高度富集于类黄酮生物合成、ABC转运蛋白和苯丙烷生物合成通路。鉴定出5个转录水平变化的ABC转运蛋白基因，qRT-PCR验证除CsABCB9外其余4个与转录组数据一致。其中CsABCI17表达水平在不同时间点与氟含量呈显著正相关，且在另外三个品种中表达趋势一致。同时检测已知氟转运蛋白基因表达，发现外源褪黑素未显著改变CsFEX1和CsFEX2表达，而CsALMT14和CsABCB9显著上调、CsNPF2.3显著下调至检测限以下。
CsABCI17的亚细胞定位及体外氟转运功能鉴定。亚细胞定位证实CsABCI17定位于质膜。ATPase活性实验表明NaF以浓度依赖方式显著刺激CsABCI17的ATPase活性（25 mg/L和50 mg/L时显著升高），提示其可直接参与氟离子转运。大肠杆菌功能验证显示CsABCI17与阳性对照CsFEX2功能相反，表达CsABCI17的菌株对氟胁迫耐受性降低且胞内氟积累显著高于表达CsFEX2的菌株，证实CsABCI17促进氟转运。
CsABCI17体内转运功能验证。拟南芥过表达实验选取CsABCI17-OE-4、OE-5和OE-7三个过表达株系，无处理条件下与野生型Col在发芽率和根长上无显著差异；100 mg/L NaF处理下过表达株系发芽率显著受抑、根长显著缩短，地上部氟含量显著高于野生型而根部无显著差异，且氟含量与CsABCI17蛋白含量显著正相关。100 mg/L NaF+100 μM褪黑素共处理后过表达株系发芽率和根长显著恢复、地上部氟含量显著降低。茶树瞬时过表达实验显示CsABCI17-GFP材料在第4天和第8天氟积累显著高于空载体对照；瞬时沉默实验显示沉默效率分别为91%和89%，36 h时氟含量较对照显著降低，进一步提供CsABCI17参与茶树氟转运的直接证据。
外源褪黑素和NaF处理对不同组织氟含量及CsABCI17表达的影响。测定‘中茶108’根、茎、叶氟含量发现外源褪黑素处理下根和茎氟含量无显著变化而叶片显著降低，计算茎至叶氟转运效率（叶氟/茎氟）发现褪黑素显著降低转运效率，证实地褪黑素通过减少氟从茎向叶转运来降低叶片氟积累，并在多个品种中验证。组织特异性表达分析显示CsABCI17在叶片中表达量最高，NaF胁迫下叶柄中CsABCI17表达显著升高，褪黑素处理则降低叶柄中CsABCI17表达。RNA原位杂交显示CsABCI17信号主要集中于韧皮部和木质部细胞，褪黑素处理后信号显著减弱。多个品种中CsABCI17表达变化与‘中茶108’一致，证实其在茎叶间氟转运中发挥保守且关键的功能。
讨论部分总结了茶树氟吸收、转运与耐受机制，指出水溶性氟是植物体内氟转运的主要形式，茶树耐氟源于代谢物含量、离子螯合、抗氧化能力和氟转运等多重机制；阐述了褪黑素在离子转运中的调控作用，指出褪黑素可通过影响ABC转运蛋白表达调控离子吸收转运，本研究首次揭示褪黑素调控茶树氟吸收转运的作用，并指出褪黑素降氟并非通过抑制根系吸收而是与体内氟转运相关，同时不能完全排除褪黑素通过其他机制（如改变蒸腾作用）间接影响氟积累的可能性，外源褪黑素下调CsABCI17减少叶片氟积累的上游调控机制有待进一步研究；对比了现有降氟策略与本研究的优劣，指出外源食品级褪黑素处理无安全隐患、成本低（约6元/亩/次）、不产生显著额外成本，是一种有推广前景的有效降氟策略，但本研究NaF处理浓度不能完全反映实际农业水平，需在不同农业生态系统中进一步长期评估。
研究结论部分翻译如下：综上，本研究确定了外源施用食品级褪黑素（最优浓度100 μM）显著降低茶树水溶性氟含量，并在多个茶树品种中验证确认。此外，研究人员发现并鉴定了一个参与氟转运的新型ABC转运蛋白CsABCI17。本研究不同于以往通过生理生化手段阐明茶树耐氟原因的研究，而是深入探究了CsABCI17参与外源褪黑素降氟的具体机制：无褪黑素处理的NaF胁迫下，CsABCI17转录升高，增强氟从茎向叶的转运，增加叶片氟含量；外源褪黑素处理缓解NaF胁迫，CsABCI17转录水平降低，减少该转运，从而降低叶片氟水平。基于这些发现，研究人员提出了CsABCI17参与外源褪黑素调控降低茶树氟含量的调控模型。本研究揭示了外源食品级褪黑素处理抑制茶树氟积累的分子机制，为开发基于褪黑素的新型植物生长调节剂保障茶叶品质与安全奠定了理论基础。褪黑素的环境友好性和广泛品种适用性为规模化应用提供了技术依据，为茶园提供了一种可复制、可扩展的绿色高效栽培管理技术。
