乳酸-GPR81/TAZ/PPARα轴诱导Bregs中ROS产生以克服免疫抑制并改善肺癌预后

《Journal of Advanced Research》：Targeting lactate-GPR81/TAZ/PPARα-induced ROS in Bregs overcomes immunosuppression and improves lung cancer outcomes

　　

肿瘤细胞通过代谢物分泌主动重编程肿瘤浸润免疫细胞的表型和功能。肿瘤中有氧糖酵解（Warburg效应）驱动乳酸（LA）在肿瘤微环境（TME）中积累。除作为糖酵解副产物外，LA日益被认为是肿瘤增殖和免疫逃逸的关键调节因子。乳酸脱氢酶A（LDHA）催化丙酮酸向LA转化。LA的免疫调节作用扩展至多种免疫细胞亚群。静息B细胞主要依赖氧化磷酸化维持细胞稳态，活化后发生代谢转换。调节性B细胞（Bregs）利用糖酵解或脂肪酸氧化调节抗炎细胞因子（如IL-10）的分泌，从而介导免疫抑制功能。既往研究表明，CD24^hiCD38^hi Bregs通过IL-10分泌抑制非小细胞肺癌（NSCLC）中CD8⁺ T细胞增殖。然而，乳酸对B细胞介导的免疫抑制的影响及其与肺癌进展的机制联系尚未被探索。本研究鉴定CD25⁺CD81⁺ B细胞为LA反应性免疫抑制亚群。机制上，LA与G蛋白偶联受体81（GPR81）结合激活这些B细胞中的PPARα/ROS轴，从而在体外损害T细胞增殖。体内药理学阻断GPR81或在D121肺癌细胞中基因敲除LDHA（以限制LA分泌）显著减弱CD25⁺CD81⁺ B细胞中ROS产生，恢复T细胞活性并延缓肿瘤生长。研究人员将ROS⁺CD25⁺CD81⁺ B细胞鉴定为驱动肺癌中LA依赖性免疫逃逸的新型Breg亚群，并提出GPR81抑制作为破坏此代谢-免疫串扰的治疗策略。

**研究背景与问题**：肿瘤细胞通过有氧糖酵解（Warburg效应）在肿瘤微环境（TME）中大量产生乳酸（LA），LA不仅作为代谢副产物，更作为关键免疫调节因子参与肿瘤免疫逃逸。既往研究已揭示LA对调节性T细胞（Tregs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和M2样巨噬细胞的免疫调节作用，但LA对B细胞介导的免疫抑制的影响及其与肺癌进展的机制联系尚未被探索。调节性B细胞（Bregs）通过分泌IL-10等抗炎因子介导免疫抑制，但其在LA刺激下的功能变化及机制尚不清楚。因此，研究人员旨在探究LA对Bregs的调控作用及其在肺癌免疫逃逸中的机制，为靶向代谢-免疫串扰提供治疗策略。论文发表于《Journal of Advanced Research》。

**关键技术方法**：研究人员采用了多种关键技术方法，包括：①临床样本分析：收集19例初诊肺腺癌患者手术切除标本及外周血，分离外周血单个核细胞（PBMCs）和血浆；②动物模型：使用C57BL/6J小鼠皮下接种D121肺腺癌细胞系及CRISPR/Cas9技术构建的LDHA敲低（LDHA KD）细胞系；③体外实验：小鼠B细胞分离培养、LA刺激、T细胞抑制实验（CFSE标记流式检测）；④流式细胞术检测Bregs表型、ROS水平、PPARα表达及T细胞增殖；⑤分子生物学技术：RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告基因实验、ELISA（检测cAMP、PKA活性、NADPH氧化酶活性、IL-2、IFN-γ）；⑥免疫荧光和免疫组化染色；⑦数据库分析：GEPIA、UALCAN和Kaplan-Meier Plotter分析LDHA表达与肺癌预后关系。临床样本来源于吉林大学第一医院2021年1月至2022年12月手术切除的19例新诊断肺癌患者。

**研究结果**：

**LA诱导B220⁺CD25⁺CD81⁺ B细胞体外扩增**：通过LA（10 mM）刺激小鼠淋巴结来源B细胞，流式细胞术检测发现B220⁺CD25⁺CD81⁺ B细胞比例显著增加，且LA处理的B细胞以剂量依赖方式强烈抑制T细胞增殖，证实LA可增强B220⁺CD25⁺CD81⁺ Bregs的免疫抑制功能。

**LA通过NADPH氧化酶促使Bregs产生ROS驱动免疫抑制**：通过检测Bregs抑制性因子分泌及ROS水平，发现LA处理的Bregs中IDO、IL-10、TGF-β无显著变化，但ROS清除剂catalase可逆转LA诱导的T细胞增殖抑制；NADPH氧化酶拮抗剂DPI同样消除此抑制效应。LA增强Bregs中NADPH氧化酶活性和关键亚基表达，而MCT1抑制剂α-CHCA不能减少ROS产生，表明LA通过NADPH氧化酶途径促进Bregs产生ROS发挥免疫抑制功能。

**LA通过GPR81受体激活诱导Bregs中ROS产生**：通过检测GPR81表达及激动剂/拮抗剂效应，发现LA显著上调B细胞GPR81表达，GPR81激动剂DHBA增加B220⁺CD25⁺CD81⁺ Bregs比例和NADPH氧化酶亚基表达，GPR81拮抗剂3-OBA则限制Bregs功能。肿瘤浸润Bregs的ROS产生显著高于脾脏对应细胞，且肿瘤来源Bregs抑制功能更强，该抑制不依赖细胞间直接接触。

**乳酸通过激活PPARα信号诱导B细胞ROS产生**：通过检测PPAR家族表达及拮抗剂效应，发现LA刺激上调B细胞PPARα和PGC-1表达，但不影响PPARβ/δ和PPARγ。GPR81激动剂DHBA增强PPARα表达，GPR81拮抗剂OBA和PPARα拮抗剂GW6471均逆转LA诱导的ROS升高及Bregs免疫抑制功能，表明PPARα是LA诱导Bregs产生ROS的关键分子。

**LDHA缺失通过损害Bregs限制肺癌进展**：通过CRISPR/Cas9技术构建LDHA敲低D121细胞系并接种小鼠，发现LDHA沉默显著减缓肿瘤生长，伴随Ki-67活性降低和免疫细胞浸润增加。LDHA缺失降低脾脏和肿瘤中B220⁺CD25⁺CD81⁺ Bregs比例及ROS产生，增强T细胞Granzyme B和IFN-γ表达及增殖能力，表明LDHA缺失通过损害Bregs积累增强抗肿瘤免疫应答。

**PPARα为Bregs中ROS产生所必需**：通过检测LDHA敲低后PPARα/ROS水平及信号通路分子，发现LDHA敲低显著降低脾脏和肿瘤中Bregs的ROS和PPARα水平，阻断GPR81或PPARα降低肿瘤浸润Bregs比例。LA通过cAMP/PKA/TAZ信号通路激活PPARα：肺癌患者血浆和细胞培养上清中cAMP水平升高，Bregs中PRKAR1A和TAZ表达增强，双荧光素酶报告实验证实TAZ反式激活PPARα启动子。体内给予OBA或catalase显著抑制肿瘤生长，与抗PD-L1抗体联合治疗效果进一步增强；GW6471或FX11联合PD-L1抗体亦显著抑制肿瘤生长。

**LDHA和ROS在肺癌中的临床相关性**：通过检测肺癌患者外周血及组织样本，发现LA刺激增加CD24⁺CD38⁺ Bregs和CD19⁺IL-10⁺ Bregs比例、NADPH氧化酶亚基表达及ROS水平。肺癌患者外周血LA水平显著升高，CD24^highCD38^high Bregs和IL-10⁺ Bregs比例与LA水平呈正相关。免疫荧光显示肿瘤组织中CD19⁺LDHA⁺ROS⁺细胞主要定位于癌组织而非癌旁组织。

**LDHA高表达为肺癌患者危险因素**：通过TCGA数据库分析，发现肺癌组织中LDHA表达显著上调，且随疾病分期进展逐步升高。Kaplan-Meier生存分析显示LDHA高表达患者总生存期、首次进展生存期和进展后生存期均较差，表明LDHA参与驱动恶性进展，可作为预后生物标志物和治疗靶点。

**讨论部分总结**：研究人员讨论了LA作为关键肿瘤代谢物通过GPR81介导免疫抑制重编程的机制。肿瘤细胞产生的大量LA与B细胞表面GPR81结合，导致Bregs比例升高和ROS产生增加，抑制肿瘤浸润T细胞生长。Bregs的诱导与转录因子PPARα和GPR81表达增加相关，可能驱动ROS产生。研究建立了LA-GPR81-PPARα轴作为肿瘤免疫逃逸的关键决定因素。研究人员还讨论了CD81和ROS作为B细胞介导免疫抑制的关键决定因素，肿瘤来源Bregs表现出更高的ROS水平和更强的免疫抑制能力，支持“肿瘤教育细胞”概念。MCT1抑制未能减弱ROS产生，提示MCT1并非唯一LA转运体。研究揭示了PPARα在LA诱导Bregs ROS产生中的核心作用，GPR81和PPARα作为双重治疗脆弱点，为开发同时靶向代谢适应和免疫逃逸电路的精准干预开辟了新前沿。

**研究结论翻译**：本研究鉴定CD25⁺CD81⁺ B细胞为LA反应性免疫抑制亚群。机制上，LA与GPR81结合激活这些B细胞中的PPARα/ROS轴，从而在体外损害T细胞增殖。体内药理学阻断GPR81或在D121肺癌细胞中基因敲除LDHA（以限制LA分泌）显著减弱CD25⁺CD81⁺ B细胞中ROS产生，恢复T细胞活性并延缓肿瘤生长。研究人员将ROS⁺CD25⁺CD81⁺ B细胞鉴定为驱动肺癌中LA依赖性免疫逃逸的新型Breg亚群，并提出GPR81抑制作为破坏此代谢-免疫串扰的治疗策略。