《Journal of Advanced Research》：Yeast protein-derived methionine alleviates ethanol-induced acute gastric mucosal injury by targeting TNF-α/NOS2 and modulating the NOD-like receptor signaling pathway
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乙醇（ethanol）消费广泛，并伴随日益增加的全球健康负担，酒精饮料中乙醇浓度与饮酒者的胃肠道症状相关。乙醇直接接触胃黏膜可诱导代谢与功能改变，这些改变可能破坏胃肠道黏膜屏障，导致急性或慢性病理状态，如胃肠道出血与溃疡。然而，化学合成药物治疗胃部疾病的长期临
乙醇（ethanol）消费广泛，并伴随日益增加的全球健康负担，酒精饮料中乙醇浓度与饮酒者的胃肠道症状相关。乙醇直接接触胃黏膜可诱导代谢与功能改变，这些改变可能破坏胃肠道黏膜屏障，导致急性或慢性病理状态，如胃肠道出血与溃疡。然而，化学合成药物治疗胃部疾病的长期临床效用受高复发率限制，因此有必要开发安全有效的天然生物活性替代物用于乙醇诱导胃黏膜损伤的预防与治疗。胃黏膜是胃的关键生理屏障，胃上皮细胞的炎性坏死是胃黏膜损伤与溃疡形成的关键病理机制。黏液碳酸氢盐屏障构成胃黏膜的初始防线，保护上皮组织免受胃酸反渗，并防止胃蛋白酶渗透所致上皮细胞水解。上皮细胞间的紧密连接构成胃黏膜的机械屏障，上皮细胞完整性是抵抗胃酸与有害物质的必要因素，紧密连接形成的封闭结构阻止胃酸与胃蛋白酶的反向扩散。微血管内层内皮细胞产生有效血管扩张剂，如NO与前列腺素（PGE），通过释放血管生成生长因子并保证充足血流保护黏膜，它们共同保护胃黏膜免受内外环境所致损伤。近期研究强调，食源性生物活性物质主要通过抑制炎症级联与氧化应激对胃黏膜发挥保护作用，包括多糖、生物碱、萜类、多酚（黄酮类与非黄酮类）、肽类及其他化合物。血清药物化学、网络药理学与多组学分析等交叉技术的进展初步阐明了酒精性胃黏膜损伤及其他消化系统疾病的机制，并探索了潜在治疗靶点与天然生物活性成分。通过这些技术，研究表明山药多糖通过降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）与白细胞介素-6（IL-6）表达水平、抑制胃组织炎症、并通过抑制脂质过氧化物防止胃氧化应激而保护胃黏膜。大豆苷元通过靶向ESR1激活PI3K/AKT/CREB信号通路，抑制细胞凋亡并保护胃黏膜完整性，从而缓解大鼠酒精性急性胃溃疡症状。氧化苦参碱通过提高NO与PGE2水平、改善胃溃疡组织氧化应激、降低炎症因子（TNF-α、IL-6）表达并阻断丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与核因子κB（NF-κB）信号通路发挥抗胃溃疡作用。此外，关于食源蛋白是否对胃黏膜损伤发挥保护作用的研究逐渐增多。全球蛋白使用量增加导致蛋白产品需求激增，开发替代蛋白成功的关键在于新蛋白具有与现有替代物相同或更优/新的功能。研究表明，定向酶解可增强蛋白的营养价值与功能特性。从动物与植物蛋白中鉴定的一些肽已显示出缓解胃部疾病的活性，谷子蛋白酶解物（关键肽氨基酸序列为GP与PG）通过提高一氧化氮合酶活性、NO水平与黏蛋白表达保护胃黏膜免受溃疡，还可降低与胃溃疡相关的氧化应激。小麦肽通过NF-κB信号通路改善胃微循环、抑制炎症反应，并对大鼠乙醇诱导的胃黏膜损伤发挥保护作用。丙氨酰-谷氨酰胺肽通过抑制NF-κB/TNF-α/H2O2信号通路抑制凋亡，在胃溃疡愈合过程中发挥辅助保护作用。酵母蛋白（YP）作为新型可持续微生物蛋白在食品工业中的应用逐渐扩大。既往研究表明酿酒酵母具有抗溃疡潜力。水解YP获得的<3 kDa多肽片段可显著缓解乙醇所致大鼠溃疡损伤，有效剂量为816 mg/kg体重，该肽片段对K-562细胞也具有良好的抗增殖活性。研究人员前期研究已证明风味酶与脂肪酶水解的YP对胃黏膜损伤发挥保护作用。目前，YP功能研究仍处于起步阶段，尤其YP与胃黏膜保护相关的靶点、关键生物活性物质及其机制有待进一步探索。为解决YP靶向营养功能（与胃黏膜保护相关）较弱及功能因子不明确的问题，本研究通过网络药理学、靶点抑制与多组学联合分析技术探索YP水解物在胃黏膜保护中的潜在应用，通过体内外实验研究从YP水解物中鉴定的生物活性化合物与健康之间的构效关系，构建生物活性化合物鉴定—靶点筛选—机制探索的研究路径，为其作为膳食补充剂中胃黏膜保护剂的应用提供参考。
研究背景方面，乙醇消费广泛且带来日益增加的全球健康负担，乙醇直接接触胃黏膜可破坏胃肠道黏膜屏障，导致出血、溃疡等急慢性病理状态；化学合成药物治疗胃部疾病存在复发率高的问题，亟需安全有效的天然生物活性替代物。食源性生物活性物质（多糖、生物碱、萜类、多酚、肽类等）主要通过抑制炎症级联与氧化应激保护胃黏膜，食源蛋白及其酶解肽的胃黏膜保护研究逐渐增多。酵母蛋白（YP）作为新型可持续微生物蛋白应用渐广，既往研究显示酿酒酵母具抗溃疡潜力，水解YP所得<3 kDa片段可缓解乙醇所致大鼠溃疡，研究人员前期亦证明风味酶与脂肪酶水解YP具保护作用，但YP功能研究仍处起步阶段，其保护胃黏膜的靶点、关键生物活性物质及机制尚不明确。为此，研究人员以网络药理学、靶点抑制与多组学联合分析为手段，构建"生物活性化合物鉴定—靶点筛选—机制探索"研究路径，系统解析YP水解物的胃黏膜保护作用，为其作为膳食补充剂中胃黏膜保护剂提供依据。该论文发表于《Journal of Advanced Research》。
关键技术方法方面，研究人员以7种食品工业常用蛋白酶酶解YP制备水解物，采用乙醇诱导SD大鼠急性胃黏膜损伤模型与4%乙醇诱导人胃黏膜上皮细胞（GES-1）损伤模型进行体内外评价；通过超滤分离（5 kDa膜）与冷冻干燥获得不同分子量组分；运用网络药理学（SwissTargetPrediction、DisGeNET数据库）预测并筛选靶点，结合靶点抑制剂（Adalimumab、L-NIL、MCC950）验证；采用RNA测序、非靶向代谢组学、肽组学与蛋白质组学（DIA）多组学联合分析，辅以分子对接筛选生物活性肽；并以免疫荧光（IF）、Western blotting（WB）、透射电镜（TEM）、ELISA与HPLC测定相关指标。
研究结果方面，"YP-P alleviates ethanol-induced acute gastric mucosal injury in SD rats"：通过动物实验比较7种酶解物，木瓜蛋白酶水解物（YP-P）损伤抑制率（DI）达50.64%，与奥美拉唑组（50.00%）相当，而YP组仅2.56%；YP-P可提高胃黏膜防御因子EGF、PGE2水平，降低胃泌素与组胺（HIS），降低血清TNF-α、IL-6并升高IL-10，表明YP-P通过提高胃黏膜防御因子水平与降低炎症发挥保护作用。"YP-P<5 kDa is the bioactive component of YP-P which alleviates gastric mucosa injury"：通过超滤分离与动物实验，YP-P<5 kDa组分DI达61.33%，优于上清（50.67%）、沉淀（16.00%）与>5 kDa组分（22.67%）；该组分显著提高EGF、PGE2、COX-1与NO水平，降低HIS，升高SOD、降低MDA，降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6；免疫荧光与WB显示其可提高紧密连接蛋白occludin、claudin-1及黏附蛋白E-cadherin表达，表明YP-P<5 kDa为关键活性组分并通过保护黏膜屏障发挥作用。"YP-P<5 kDa alleviates ethanol-induced gastric mucosal injury in GES-1 cells"：通过细胞实验确定YP-P与YP-P<5 kDa最佳浓度分别为1200 μg/mL与240 μg/mL，YP-P<5 kDa组细胞活力（74.61%）最高，显著提高SOD、ADH活性、降低MDA与ROS水平，透射电镜显示其改善线粒体损伤，与动物实验结果一致。"YP-P<5 kDa alleviates gastric mucosal injury by targeting TNF-α and NOS2"：通过非靶向代谢组学与肽组学确认该组分分子量低于5 kDa，血清代谢组学显示YP-P<5 kDa与模型组差异代谢物主要为氨基酸与肽；网络药理学筛选出TNF-α与NOS2两个潜在靶点及Arg、灵芝酸F等潜在关键化合物；靶点抑制剂实验表明Adalimumab降低TNF-α含量、L-NIL降低NO含量且二者互不影响，证实YP-P<5 kDa通过靶向TNF-α与NOS2缓解损伤。"Identification and screening of key bioactive compound for YP-P<5 kDa"：通过血清氨基酸定量与细胞实验筛选，Met组细胞活力（69.52%）、NO含量与ROS荧光强度表现与奥美拉唑及YP-P<5 kDa组无显著差异，Hoechst 33342/PI双染显示Met组红蓝荧光强度较低，确定Met为关键生物活性化合物，其毒性浓度为80 μg/mL、最佳剂量效应浓度为40 μg/mL；同时经肽组学与分子对接从39条肽中筛选出6条潜在生物活性肽（DEFKGYVF、DLFGFLAR、WEKPIIIG、DGAFVKFL、EALDFFAR、KPLDVFL）并进行细胞活性验证。
讨论与结论部分，研究人员围绕YP水解物的胃黏膜保护功能因子与作用机制展开系统解析，明确YP-P<5 kDa为关键活性组分、Met为关键生物活性化合物，并阐明其通过靶向TNF-α/NOS2及调控NOD样受体信号通路发挥作用。研究结论为：酵母蛋白经木瓜蛋白酶水解所得YP-P对乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤具有保护作用；YP-P<5 kDa是YP-P的关键活性组分，可有效逆转乙醇诱导的炎症；YP-P<5 kDa通过靶向TNF-α/NOS2并调控NOD样受体信号通路缓解乙醇诱导的胃黏膜损伤；Met被鉴定为YP-P<5 kDa中保护胃黏膜的关键生物活性化合物。
