染料配体功能化胶原纤维作为高效蛋白质分离的亲和色谱固定相

《Collagen and Leather》：Dye-ligand functionalized collagen fibers as an affinity chromatography stationary phase for efficient protein separation

　　

染料分子作为有前景的亲和配体在生物分离应用中具有重要潜力。本研究通过将活性染料（活性红118、活性蓝171、活性蓝19、活性蓝114、活性蓝21和活性蓝116）固定在胶原纤维（CFs）上，制备了一系列染料亲和胶原纤维（CFs-Dye）固定相，用于溶菌酶（LyZ）的选择性分离与纯化。吸附容量与染料配体的分子结构密切相关。在所合成的固定相中，蒽醌类染料亲和胶原纤维表现出优异的吸附性能。得益于胶原纤维的纤维状结构和蒽醌结构的特异性亲和力，固定化活性蓝114的胶原纤维（CFs-RB114）展现出突出的静态吸附容量（1594.23 mg/g）和动态吸附容量（1504.28 mg/g），以及对LyZ的优异选择性（SFLyZ/OVA：87.59；SFLyZ/BSA：96.56）。采用NaCl、异丙醇和尿素进行的抑制实验表明，CFs-RB114与LyZ之间的吸附机制涉及静电吸引、疏水相互作用和氢键的协同作用。作为亲和色谱固定相，CFs-RB114通过阶梯洗脱实现了卵清蛋白（OVA）和LyZ的完全分离。此外，CFs-RB114能够成功从鸡蛋清中直接提取LyZ。本研究提出了一种新型高性能亲和吸附剂，在LyZ提取和纯化方面具有卓越效能，在生物分子实际应用中展现出广阔前景。

研究背景：蛋白质分离纯化在生物医药和食品工业中具有重要意义，柱色谱是其中最广泛使用的技术手段，而分离效率在很大程度上取决于固定相的性能。传统固定相以多孔颗粒为主，减小粒径虽可提高分离效率，但往往导致背压升高和配体利用率降低。纤维状固定相因传质阻力低、流速高而受到越来越多关注。胶原纤维（CFs）是从牲畜皮中提取的天然纤维，具有独特的多级纤维网络结构，有利于蛋白质传输，且侧链富含-COOH、-OH、-NH₂和-CONH-等官能团，便于多样化化学修饰。然而，未经修饰的CFs存在吸附位点不足和结合力弱等固有局限，难以实现高效蛋白质分离。染料亲和色谱是一种经济高效且稳定的分离技术，利用合成染料与天然生物分子之间的结构相似性实现对特定蛋白质的结合。与其他类型染料相比，活性染料可在不使用有毒试剂的条件下与含羟基或氨基的纤维共价结合。此前研究已证明聚乙烯亚胺功能化CFs对牛血清白蛋白（BSA）具有优异吸附容量（1133.34 mg/g）和分离选择性（SFBSA/BHb=69.67），但CFs作为亲和色谱固定相基质的潜力尚待深入探索。基于此，研究人员以CFs为载体、活性染料为亲和配体，制备了一系列CFs基色谱固定相（CFs-Dye），并以溶菌酶（LyZ）为模型蛋白，系统考察其分离性能与吸附机制。论文发表在《Collagen and Leather》。

关键技术方法：研究人员将六种活性染料（活性红118、活性蓝171、活性蓝19、活性蓝114、活性蓝21和活性蓝116）共价固定于牛皮来源的CFs上制备CFs-Dye，通过扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）和Zeta电位进行表征；采用批式吸附实验考察吸附动力学、吸附等温线、pH效应和选择性吸附；通过色谱柱动态吸附实验结合Thomas模型分析穿透行为；利用分子对接、荧光猝灭光谱及NaCl、异丙醇和尿素干扰实验解析吸附机制；并以鸡蛋清（CEW）为实际样品验证分离效果。

研究结果：

3.1 CFs-Dye的表征：SEM和EDS结果表明，与原始CFs相比，CFs-Dye表面更粗糙且D周期性消失，CFs-RB114仍保留可见的纤丝结构，有利于LyZ的快速吸附和解吸，S元素在CFs-Dye表面均匀分布，CFs-RB114的S含量达到2.88%。FTIR光谱中接枝染料配体后出现1030 cm^?1的新峰，归因于-SO₃Na官能团。XPS谱图中出现S 2p峰（167.19 eV），CFs-RB114在168.22和166.97 eV处的峰分别对应S 2p1/2和S 2p3/2，来源于染料分子的磺酸基团（-SO₃）。上述结果证实染料配体成功接枝到CFs上，为LyZ提供了丰富的亲和吸附位点。Zeta电位显示CFs-RB114在pH 4.0–11.0范围内带负电，且随pH升高负电性增强。

3.2 CFs-Dye对LyZ的吸附性能：染料配体类型实验表明，未功能化CFs吸附能力较差，CFs-RB114的LyZ吸附容量最高（1000.30 mg/g），其次为CFs-RB19，而酞菁类染料亲和CFs（CFs-RB116和CFs-RB21）吸附能力有限，说明母体染料的化学结构是影响吸附容量的关键因素，蒽醌类染料有利于LyZ吸附。分子对接结果显示蒽醌类染料（RB19和RB114）主要结合于LyZ的大疏水腔内，RB19和RB114分别与9个和7个氨基酸残基发生疏水相互作用，其磺酸基团提供多种极性相互作用；偶氮染料（RR118和RB171）疏水相互作用有限，主要依赖表面静电相互作用；酞菁染料虽具有多个结合位点，但庞大刚性的大环骨架阻碍了有效相互作用。pH效应实验显示，CFs-RB114对LyZ的吸附容量随pH从4.0升至8.0逐渐增加，pH 8.0时达到最大值1536.92 mg/g；由于LyZ等电点为10.7，在pH 10.7以下带净正电荷，与带负电的CFs-RB114之间产生强静电吸引；pH 11.0时两者均带负电，CFs-RB114仍表现出优异吸附容量，提示存在多种吸附相互作用。选择性实验中，CFs-RB114对BSA和OVA的吸附容量极低（分别为151.38和172.85 mg/g），在双组分混合溶液中LyZ吸附容量仅略微降至约870 mg/g，对BSA和OVA的分离因子分别为96.56和87.59。洗脱实验中，pH 8.0条件下洗脱率高于pH 4.0，但仅用1 M NaCl和1 M (NH₄)₂SO₄洗脱时洗脱率仅为65.23%和53.19%，而含20%乙醇的1 M NaCl磷酸缓冲液（pH 8.0）可洗脱97.01%的吸附LyZ，表明CFs-RB114与LyZ之间存在多种相互作用力。重复使用性实验显示，经三次吸附-解吸循环后CFs-RB114仍保留80%以上的初始吸附容量。动力学与等温线模型实验表明，LyZ吸附在最初1 h内快速进行，4 h内达到动态吸附平衡，温度从25 °C升至35 °C时平衡时间缩短；伪二级动力学模型拟合的相关系数高于伪一级模型，说明表面吸附是限速步骤；Langmuir模型拟合优于Freundlich模型，25、30和35 °C时实验最大吸附容量分别为1594.23、1701.51和1939.13 mg/g，计算最大吸附容量分别为1586.06、1699.21和1960.66 mg/g，与实验值高度吻合，表明吸附过程为吸热过程。

3.2.5 可能的吸附机制：分子对接结果显示，RB114的磺酸基团可与LyZ的Glu35、Asp48、Asp52、Arg61和Arg114残基形成静电相互作用，LyZ的Phe34、Trp62、Trp63、Ile98、Ala107、Val109和Ala110残基与RB114形成疏水相互作用，Thr47、Asp48和Arg114残基形成氢键。荧光光谱和热力学分析表明，RB114通过形成基态复合物导致LyZ荧光猝灭，Trp残基为主要结合位点；各温度下结合常数（Ka）均超过10⁴ L/mol，表明存在强结合；ΔG均为负值，证实结合为自发过程；ΔH（150.40 KJ/mol）和ΔS（619.43 J/(mol·K)）为正值，表明疏水相互作用在结合中占主导地位。NaCl干扰实验显示，NaCl浓度从0 M增至1.0 M时LyZ吸附容量从1428.11 mg/g显著降至610.83 mg/g，但1.0 M NaCl条件下仍保留无NaCl时42.77%的吸附容量，与洗脱结果一致，表明多种相互作用共存而静电相互作用为主导。在1.0 M NaCl存在下，异丙醇浓度增至2.6 M（20%）时吸附容量降至150.67 mg/g，表明疏水相互作用的贡献；尿素浓度增至1.0 M时吸附容量仅略有下降，表明氢键的贡献。综上，CFs-RB114对LyZ的吸附由静电相互作用（主导）、疏水相互作用和氢键的协同作用所支配。

3.3 柱吸附：CFs-RB114的动态吸附性能通过不同流速下连续进样LyZ溶液评价，穿透曲线呈典型S型。流速0.25 mL/min时，CFs-RB114柱在到达穿透点（t_b=4882 min）前可处理103.60 BV（V_b=1220.5 mL）的LyZ溶液（1.0 mg/mL）；流速增至0.5 mL/min时穿透点降至2063 min，N_b、V_b和MTZ均减小。Thomas模型拟合显示K_TH值随流速增加从1.23×10^?6增至1.95×10^?6 L/(mg·min)，表明高流速下LyZ与CFs-RB114接触时间不足；但Thomas模型计算的理论吸附容量（q₀）在0.25和0.50 mL/min流速下分别为1504.28和1423.77 mg/g，流速加倍时动态吸附容量仅下降5.4%，归因于CFs的纤维结构有利于LyZ的高效传输。

3.4 二元OVA-LyZ溶液的色谱分离：通过阶梯洗脱评价CFs-RB114的色谱分离性能，OVA被磷酸缓冲液（pH 8.0）快速洗脱，而LyZ被选择性保留在CFs-RB114上，与静态吸附实验所揭示的CFs-RB114对LyZ的强亲和力一致；随后LyZ在第二阶段被含20% IPA的1.2 M NaCl磷酸缓冲液（pH 8.0）洗脱，R_OVA/LyZ分辨率为0.66，OVA和LyZ的回收率分别为99.35%和82.57%，表明CFs-RB114对蛋白质混合物具有优异的色谱分离性能。

3.5 鸡蛋清中LyZ的分离：基于优异的吸附容量和选择性，研究人员进一步考察CFs-RB114从新鲜鸡蛋清（CEW）中提取LyZ的效果。HPLC色谱图显示，标准LyZ溶液（1.0 mg/mL）在13.85 min保留时间处出现特征峰；原始CEW溶液（4倍稀释）在13.87 min处呈现弱峰，归因于CEW中LyZ含量较低（约3.5%）；经CFs-RB114吸附后鸡蛋清溶液中LyZ峰消失；从吸附LyZ的CFs-RB114洗脱后，色谱图中清晰观察到LyZ峰。结果表明，以CFs-RB114为固定相可从CEW中选择性分离出高纯度LyZ。

讨论与结论：本研究成功开发了多种染料亲和CFs用于LyZ的分离纯化。基于CFs独特的纤维结构和RB114特定的化学结构，所制备的CFs-RB114对LyZ表现出优异的吸附容量和选择性。在1.8 mg/mL LyZ浓度下最大吸附容量为1594.23 mg/g，流速0.25 mL/min时动态吸附容量达1504.28 mg/g。此外，CFs-RB114对LyZ具有优异的吸附选择性和良好的重复使用性，三次循环后仍保留80%的初始吸附容量。优异的吸附性能归因于RB114的磺酸基团、芳香环和嘧啶活性基团所促进的静电吸引、疏水相互作用和氢键的协同效应。在色谱分离实验中，OVA和LyZ通过阶梯洗脱被快速完全分离，分辨率达0.66，回收率高（OVA为99.35%，LyZ为82.57%）。此外，CFs-RB114成功从鸡蛋清溶液中直接提取和分离LyZ。本研究为蛋白质的高精度分离纯化提供了一种新颖高效的策略。