谷胱甘肽/酶双响应覆盆子状载阿维菌素磁性有机硅/GelMA复合微球农药递送体系的构建与应用

《Collagen and Leather》：Application of responsive raspberry-like AVM-loaded GelMA/magnetic organosilicon microspheres in pesticide delivery

　　

为解决传统农药制剂生物安全性低且难以实现可控释放的问题，本研究将甲基丙烯酰化明胶（GelMA）与载阿维菌素磁性中空介孔有机硅纳米颗粒（A@mMON）整合，构建了一种覆盆子状多尺度复合微球（A@mMON@G）。这些微球在谷胱甘肽（GSH）和酶介导条件下实现了疏水性农药的可控释放，并展现出良好的生物安全性和可回收性。有机硅的封装效应使载药农药在模拟昆虫GSH环境中的释放时间达到商业阿维菌素乳油的两倍。在杀虫实验中，棉铃虫和蚜虫的死亡率分别达到了96.2%和93.1%。盆栽和田间实验进一步证实了其在实际条件下的持久保护性能。在处理48小时后，A@mMON@G组斑马鱼的半数致死浓度（LC50）约为商业阿维菌素乳油的3.5倍，且在水体和土壤中的回收率分别达到92.1%和72.9%。本研究为开发兼具高效递送、智能响应和生态安全的农药载体提供了新策略。

1. 研究背景

农业生产中农药利用率低下是一个普遍性问题，而过量使用农药以提高防治效果会进一步导致土壤污染、水体富营养化以及毒性在生态链中累积。由于大多数农药活性物质是疏水性的，传统农药制剂通常需要加入大量表面活性剂来改善其在水中的分散性。然而，这类制剂的生物安全性较低，并且难以实现对农药的可控释放。智能农药递送系统因其具备“按需释放和精准递送”的特性而受到广泛关注。刺激响应型载体是一类新型材料，能够根据环境变化（如pH值、温度、酶、光照等）调控农药的释放行为。其中，纳米级制剂凭借高渗透性可以显著增强药效，但其释放行为易受环境影响；相比之下，微米级载体的药物扩散路径更长，因此比纳米级制剂具有更好的缓释性能。基于此，研究人员旨在构建一种基于微米级微球结合纳米功能单元的多尺度农药递送系统，通过整合互补的载体功能来提高缓释性能和生物安全性。此前的研究已经开发了明胶包被的磁性有机硅微球系统用于响应性阿维菌素（AVM）递送，本项研究在此基础上进一步推进了载体设计，引入了可光交联的多孔GelMA微球作为可调控的结构支架，并提出利用这些组件构建覆盆子状分级结构，以实现酶/GSH响应性释放、持续农药递送和磁回收功能，并将载体评价从实验室和盆栽实验拓展到田间条件，从而为智能农药递送提供新的解决方案。该论文发表于《Collagen and Leather》。

2. 关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：（1）通过微流控技术结合紫外光交联制备单分散性良好的GelMA微球，并通过梯度冷冻凝胶法（先在-20°C预冷20分钟，再经液氮速冻后冷冻干燥）调控微球的孔径；（2）以一锅模板法合成包裹四氧化三铁（Fe₃O₄）纳米颗粒、骨架内均匀嵌入二硫键的磁性中空介孔有机硅纳米颗粒（mMON），并通过浸渍吸附法负载阿维菌素（AVM）得到A@mMON；（3）通过溶胀-吸附法将A@mMON装载到多孔GelMA微球中，构建覆盆子状的A@mMON@G复合微球。

3. 研究结果

3.1 多孔GelMA微球的制备

研究人员通过核磁共振氢谱（¹H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的成功合成，其甲基丙烯酸化程度约为75.5%。利用微流控装置结合光交联制备了高度单分散的GelMA水凝胶微球。通过固定分散相流速为20 μL/min，调节连续相流速（200至2000 μL/min），发现微球尺寸随剪切力增大而减小，最终选择分散相20 μL/min、连续相500 μL/min的条件进行后续制备。扫描电子显微镜（SEM）结果显示，在-20°C预冷20分钟后再经液氮速冻并冷冻干燥的微球呈现出蜂窝状多孔结构，孔径约为8.6 μm，有利于后续装载载药纳米颗粒。

3.2 A@mMON纳米颗粒的制备

透射电子显微镜（TEM）和能谱分析（EDS Mapping）显示所制备的mMON呈单分散球形，粒径约83.1 nm，具有中空结构，且Fe、S、Si元素分布均匀。FT-IR和X射线衍射（XRD）分析证实了Fe₃O₄的成功复合以及AVM的成功装载。氮气吸附-脱附测试表明mMON的比表面积高达143.6 m²/g，孔径集中分布在约2.8 nm；装载AVM后，比表面积显著下降至77.1 m²/g，证明AVM成功填充了介孔通道。通过优化AVM与mMON的质量比，在5:5的比例下获得了最高的包封效率（68.2%）和载药量（28.8%）。

3.3 覆盆子状A@mMON@G微球的制备

通过将多孔GelMA微球浸泡在A@mMON分散液中，利用溶胀-吸附作用制备了A@mMON@G微球。SEM图像显示微球表面被A@mMON覆盖，呈现覆盆子状结构。EDS Mapping证实了N、O、Si、Fe等元素的存在。通过优化mMON与GelMA的质量比，发现在1:2的比例下mMON的装载率最高（68.2%）。FT-IR和XRD分析进一步证实了复合微球的成功构建以及AVM在其中的晶体形态保持。

3.4 回收性能分析

振动样品磁强计（VSM）测量显示，Fe₃O₄、mMON和mMON@G微球的饱和磁化强度分别为77.72、20.9和5.1 emu/g，具有良好的磁响应性。在质量比为1:2的条件下，mMON@G微球在水体和土壤中的磁回收率分别达到了92.1%和72.9%。

3.5 降解与药物释放行为

体外释放实验表明，在仅有中性蛋白酶存在的条件下，A@mMON@G微球在96小时内的累积释放率为59.7%，与无刺激条件相似。而在含有谷胱甘肽（GSH）或GSH加酶的介质中，释放速率显著加快，96小时的累积释放率分别达到96.2%和98.4%。这表明GSH对有机硅骨架中二硫键的断裂起到了关键的触发作用。与商业阿维菌素乳油（EC-AVM）相比，A@mMON@G微球将释放周期从48小时延长至96小时，展现了良好的缓释行为。动力学拟合分析（Ritger-Peppas模型）显示，在含GSH条件下，释放指数n值大于0.85，表明AVM的释放主要由基质松弛和结构侵蚀机制主导。

3.6 杀虫性能

通过叶片浸渍法评估了A@mMON@G微球对棉铃虫和蚜虫的杀虫活性。对于棉铃虫，处理24小时后，A@mMON@G组的死亡率为96.2%，高于EC-AVM组（92.5%）和AVM溶液组（85.5%），且叶片损伤最轻。对于蚜虫，处理8小时后，A@mMON@G组的死亡率为93.1%，同样高于EC-AVM组（90.2%）和AVM溶液组（83.3%）。结果表明，A@mMON@G微球展现出优于商业化制剂的杀虫效果。

3.7 生物安全性分析

种子萌发和鲜重实验显示，在高浓度（500 mg/L）下，纯AVM溶液对黄瓜种子的萌发率和鲜重产生了显著的抑制作用，而A@mMON@G微球组则保持了接近100%的萌发率和较高的鲜重（70-80 mg），表明其植物毒性更低。斑马鱼急性毒性实验结果显示，处理48小时后，A@mMON@G微球的半数致死浓度（LC₅₀）为167.01 μg/L，是AVM溶液（47.71 μg/L）和EC-AVM（47.93 μg/L）的约3.5倍，说明其对水生生物的毒性显著降低。

3.8 盆栽实验与田间实验

盆栽实验表明，在处理3天后，A@mMON@G微球对棉铃虫的死亡率为90.4%，高于AVM溶液（76.1%）和EC-AVM（80.9%），且白菜叶片受损更轻微。田间示范实验（于广州市果树科学研究所示范基地进行）持续14天，结果显示，A@mMON@G微球处理组的蔬菜生长旺盛，叶片完整，无明显虫害迹象，而对照组（水和空白微球）植株矮小，叶片严重黄化并遭受严重虫害。AVM溶液和EC-AVM组的防效随时间推移而减弱，这表明A@mMON@G微球在田间条件下具有更持久的保护性能。

4. 结论与讨论

本研究成功构建了基于多孔GelMA微球和载药磁性中空介孔有机硅纳米颗粒的覆盆子状多尺度复合微球（A@mMON@G）。该系统整合了多种功能：GelMA的多孔结构提供了酶响应性和可调的微观骨架；有机硅骨架中的二硫键赋予了谷胱甘肽（GSH）响应性；Fe₃O₄的引入使其具备磁回收能力。研究结论指出，在模拟害虫体内的微环境（GSH加酶）下，该微球表现出长达96小时的缓释特性，是商业阿维菌素乳油的两倍，并在水体和土壤中分别实现了92.1%和72.9%的高回收率。杀虫实验表明，A@mMON@G微球对棉铃虫和蚜虫均具有优异的抑制效果，死亡率分别达到96.2%和93.1%。生物安全性评估方面，种子萌发、鲜重测定以及斑马鱼毒性实验共同证实了其较低的植物毒性和水生毒性，其对斑马鱼的48小时LC₅₀值（167.01 μg/L）远高于商业制剂。盆栽和田间实验进一步验证了其在实际应用中的持久保护性能。总而言之，该研究为开发集响应性、可控释放和高生物安全性于一体的新型农药载体提供了有效的新策略。