6-氯-2-羟基-1-萘甲醛衍生物作为HEG1–KRIT1蛋白–蛋白相互作用干扰剂的计算机与实验筛选鉴定

《Scientific Reports》：Computational and experimental screening identifies 6-chloro-2-hydroxy-1-naphthaldehyde derivatives as disruptors of the HEG1–KRIT1 protein–protein interaction

　　

HEG1–KRIT1蛋白–蛋白相互作用（PPI）是脑海绵状血管畸形（CCM）信号传导中的核心调控界面，也是小分子调控的潜在靶点。本研究对包含2-羟基-1-萘甲醛骨架的1,121个化合物的聚焦库进行筛选，以鉴定候选HEG1–KRIT1干扰剂。化合物经类药性过滤、PAINS/反应性评估、多样性与可购性评价、AutoDock Vina对接、短时分子动力学精修及MM/PBSA重打分进行优先级排序。选取HN1、HN2和HN3三个候选物进行1000 ns分子动力学模拟、自由能分析、计算机ADMET谱分析，并采用基于微珠的流式细胞术HEG1–KRIT1竞争实验进行评估。对接与模拟分析提示，三个候选物均可占据KRIT1 FERM结构域的HEG1识别区域，并在模拟过程中维持配体–蛋白接触。在受试化合物中，HN1给出适度的正ΔΔG_PPI估计值（+2.66 kcal/mol），而HKi2、HN2和HN3给出负值；这些数值被描述性地解读为配体依赖性HEG1–KRIT1界面变化的近似指标。实验检测显示对EGFP–KRIT1 FERM与HEG1包被微珠结合的浓度依赖性抑制。在所应用的实验条件下，HN1产生的IC₅₀估计值数值最低，为3.51 ± 0.14 μM，HKi2为3.90 ± 0.13 μM，而HN2和HN3的IC₅₀估计值分别为24.12 ± 1.59和31.63 ± 1.99 μM。这些数值差异不能确立化合物间的优效性或等效性。总体而言，计算与实验发现支持HN1作为初步命中物，值得进一步的靶点结合、机制及细胞水平验证。

研究背景方面，脑海绵状血管畸形（CCM）是中枢神经系统低流量血管病变，由扩张的内皮衬里海绵状腔隙构成，临床可无症状，也可表现为癫痫、局灶性神经功能缺损、头痛或脑内出血。家族性CCM与KRIT1/CCM1、CCM2和PDCD10/CCM3的致病性变异相关，其蛋白产物作为内皮信号复合物发挥维持血管稳定性和连接完整性的功能。CCM信号缺失破坏内皮屏障调控，涉及RhoA–ROCK活性及内皮MEKK3–KLF2/4信号获得，这些通路与CCM病灶形成和血管功能障碍相关。该通路的核心事件是心脏玻璃蛋白1（HEG1）将KRIT1招募至内皮连接处，HEG1是一种跨膜蛋白，将连接膜定位与CCM复合物信号耦联。结构研究显示KRIT1 FERM结构域结合HEG1胞质尾，HEG1 C端Tyr-Phe基序占据KRIT1 F1/F3界面形成的疏水沟槽。KRIT1还能与Rap1及HEG1同时结合，支持KRIT1在内皮细胞–细胞连接处整合膜锚定与小GTP酶信号的模型。因此，干扰该界面为探究HEG1–KRIT1复合物重塑下游早期信号事件提供了聚焦策略。尽管蛋白–蛋白相互作用通常难以用小分子调控，但KRIT1的HEG1结合沟槽呈现结构明确的口袋，可用于抑制剂发现。小分子HEG1–KRIT1抑制剂HKi2被证明与HEG1正构竞争结合KRIT1 FERM结构域，占据与HEG1胞质尾相同的结合口袋，并与KRIT1 Lys720形成可逆共价相互作用。急性抑制HEG1–KRIT1相互作用可增加内皮细胞中KLF4和KLF2的mRNA及蛋白水平，并在斑马鱼中诱导内皮klf2a表达，确立HKi化合物作为探究HEG1–KRIT1依赖性信号的药理学探针。近期，2-羟基-1-萘甲醛（HNA）被表征为KRIT1 Lys720的位点导向可逆共价配体；HNA表现出选择性KRIT1结合、延长驻留时间及抑制HEG1–KRIT1相互作用，而HNA衍生物显示出改善的靶点结合与抑制活性。基于此，研究人员旨在通过对2-羟基-1-萘甲醛骨架针对KRIT1 HEG1结合口袋的聚焦虚拟筛选，鉴定干扰HEG1–KRIT1相互作用的新先导候选物，并用1000 ns分子动力学模拟考察结合稳定性、关键接触持续性和KRIT1界面内构象动力学，最后用基于微珠的流式细胞术竞争实验对计算预测进行实验检验，提供整合结构导向与实验的HEG1–KRIT1 PPI干扰剂优先级排序工作流程。

研究人员开展的研究为：对1,121个含2-羟基-1-萘甲醛骨架的聚焦化合物库实施分层虚拟筛选，先按分子量、计算logP/logD、拓扑极性表面积、氢键供体/受体数及可旋转键等类药理化性质过滤，排除含PAINS或潜在反应性亚结构的化合物，再经多样性与可购性筛选，随后用AutoDock Vina对接并按预测结合亲和力及HEG1胞质尾–KRIT1 FERM结构域界面附近构象一致性排序，顶级化合物经短时分子动力学精修评估构象稳定性、配体RMSD和接触占有率，再经MM/PBSA重打分，最终产出HN1、HN2、HN3三个优先候选物。研究结论为：计算与实验结果支持HN1作为初步筛选命中物，2-羟基-1-萘甲醛骨架可作为进一步优化的潜在起点；需额外研究确认直接KRIT1结合、评估选择性与非特异性反应性、用正交生化与细胞实验确立活性，并确定HN1对KLF2和KLF4等下游CCM信号标志物的影响。其重要意义在于建立了整合结构导向虚拟筛选、长时程分子动力学与生化竞争实验的工作流程，为靶向HEG1–KRIT1界面的小分子发现提供了可复制的优先级排序策略，并将HN1确立为值得进一步靶点结合、机制及细胞验证的初步命中物。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用聚焦虚拟筛选（起始库1,121个含2-羟基-1-萘甲醛骨架化合物），经类药性过滤、PAINS/反应性评估、多样性与可购性筛选；AutoDock Vina对接（受体取自PDB ID 6OQ3的KRIT1晶体结构，搜索盒20×20×20 ?，中心x=85.08、y=18.85、z=10.88 ?），并用共结晶HKi2自对接验证方案；GROMACS 2022.4结合CHARMM36力场与TIP3P水模型进行1000 ns全原子分子动力学模拟；gmx_MMPBSA v1.6.3进行MM/PBSA结合自由能与ΔΔG_PPI计算；PCA与SHAM法构建自由能景观（FEL）；ADMETlab 3.0进行计算机ADMET预测；基于SPHERO NeutrAvidin微珠的流式细胞术HEG1–KRIT1竞争实验，以His₆–EGFP–KRIT1 FERM（残基417–736）与HEG1胞内尾包被微珠结合，BD Accuri流式细胞仪读取几何平均荧光强度（GMFI），四参数逻辑模型拟合IC₅₀。样本队列来源为商业化可购化合物库，未涉及临床样本队列。

研究结果方面，分步虚拟筛选漏斗优先产出三个2-羟基-1-萘甲醛候选物作为推定HEG1–KRIT1干扰剂：通过多标准序贯筛选，最终确定HN1（6-氯-2-羟基-1-萘甲醛）、HN2（2-羟基-6-[5-(4-甲基哌嗪-1-羰基)噻吩-2-基]-1-萘甲醛）和HN3（2-羟基-6-[5-(4-吗啉基羰基)-2-噻吩基]-1-萘甲醛），三者均可商业获得且在实验检测前选定，其后续IC₅₀值未用于回溯性优先级排序。对接分析支持HN1–HN3结合于KRIT1的HEG1识别口袋：三个衍生物占据与参考抑制剂HKi2相同的表面可及口袋，HN1呈紧凑取向，HN2和HN3通过噻吩连接取代基更深延伸跨越结合沟槽；三者均接触HEG1结合位点附近残基，包括Gln473、Lys475、Val512、Ala638、Phe640、Leu717和Leu721等反复出现的相互作用，HN2和HN3还涉及His478、His483、Ile490和Leu494等额外残基，提示扩展类似物提供更广泛的界面覆盖。MM/PBSA PPI能量分析鉴定HN1为唯一对HEG1–KRIT1界面有预测削弱作用的候选物：以apo HEG1–KRIT1复合物界面自由能?59.86 ± 9.49 kcal/mol为参照，HKi2的ΔΔG_PPI为?0.33 kcal/mol，HN1是唯一呈正ΔΔG_PPI的化合物（+2.66 kcal/mol，界面能?57.20 ± 9.45 kcal/mol），与适度预测削弱一致；HN2和HN3的ΔΔG_PPI分别为?17.00和?7.91 kcal/mol，提示相对稳定化而非干扰，但其计算伴随大的相反静电与溶剂化项及高标准差，不确定性较大。HN1–HN3扰动天然HEG1–KRIT1界面但维持整体复合物结合：apo模拟中整体HEG1–KRIT1质心距离稳定于3.631 ± 0.097 nm，天然界面质心距离维持于0.627 ± 0.048 nm；HN1、HN2和HN3使天然界面质心距离分别增至0.748 ± 0.042、0.763 ± 0.060和0.694 ± 0.043 nm，支持天然接触区部分开放或重排；天然接触丢失从apo的0.158 ± 0.131升至HN1、HN2、HN3的0.229 ± 0.086、0.222 ± 0.090和0.223 ± 0.091，界面氢键从1.893 ± 0.619显著降至0.364 ± 0.692、0.561 ± 0.586和0.557 ± 0.649，而配体–蛋白接触仍大量维持（HN1和HN2分别为94.247 ± 16.089和102.016 ± 31.331个0.45 nm内接触）；SASA/BSA分析显示HN结合体系总BSA从apo/HKi2的约3.225 nm2增至约20.35 nm2，提示形成更大重塑的链间接触面而非完全解离。HN1–HN3维持整体HEG1–KRIT1结构稳定性并诱导适度配体依赖性构象变化：所有体系在1000 ns内结构稳定，apo骨架RMSD最低（0.231 ± 0.035 nm），配体结合体系略升至0.280–0.319 nm；回转半径分布狭窄（2.515–2.533 nm），RMSF谱相似，无广泛去稳定化。FEL分析揭示配体特异性构象盆地支持HN1–HN3稳定结合KRIT1：HKi2呈宽泛低能区伴多个相连极小值，HN1沿PC1和PC2呈更延展景观并有明确低能盆地，HN2呈更宽连续低能面，HN3呈相对紧凑低能盆地；最低能量构象显示HN1定位于界面口袋，HN2和HN3呈更延展结合排列。配体–KRIT1能量分析鉴定HN2为最强KRIT1结合候选物，主要由短程范德华接触驱动：HKi2的ΔTOTAL为?18.51 ± 2.37 kcal/mol，HN1、HN2和HN3分别为?17.31 ± 3.30、?18.96 ± 2.97和?16.36 ± 3.71 kcal/mol；HN2短程Lennard–Jones相互作用最强（?123.18 ± 29.61 kJ/mol），HN1为?95.90 ± 16.68 kJ/mol，HN3为?90.03 ± 30.61 kJ/mol，HKi2为?64.49 ± 26.80 kJ/mol；逐残基能量分解显示结合分布于多个有利残基接触而非单一残基主导。ADMET谱分析支持HN1–HN3作为类药筛选命中物但识别出需优化缺陷：三者均零Lipinski违规，QED为0.707–0.729，合成可及性低；HN1分子量206.01 g/mol、TPSA 37.30 ?2、1个可旋转键、logP 3.793，HN2和HN3分子量分别为380.12和367.09 g/mol、TPSA 60.85和66.84 ?2；三者肠道吸收评分有限、血浆蛋白结合高、BBB通透性可变（HN2最高）；HN1预测为CYP1A2抑制剂，HN2和HN3多数亚型CYP抑制较低；毒性输出提示HN2和HN3高Ames致突变性、致癌性、DILI、肾毒性和神经毒性风险，HN1呈强反应性化合物评分和高皮肤致敏风险，故三者应视为初步命中物而非优化先导物。HN1在体外显示与HKi2相当的HEG1–KRIT1干扰作用：基于微珠的流式细胞术竞争实验证实三个候选物均浓度依赖性抑制EGFP–KRIT1 FERM与HEG1包被微珠结合；阳性对照HKi2的IC₅₀为3.90 ± 0.13 μM，HN1的IC₅₀为3.51 ± 0.14 μM，为系列中数值最低，与计算PPI干扰分析中HN1为唯一正ΔΔG_PPI并显示天然界面明显扰动一致；HN2和HN3抑制效力较低，IC₅₀分别为24.12 ± 1.59和31.63 ± 1.99 μM，提示稳定KRIT1结合本身不足以实现有效竞争性干扰，配体取向、天然HEG1识别表面占据及削弱有效HEG1–KRIT1接触的能力更为重要。与既往研究相比，HKi1为低微摩尔HEG1–KRIT1抑制剂（IC₅₀约10 μM），其较小衍生物HKi2和HKi3效力改善至约3.5 μM，优化后的HKi6显示改善的KRIT1亲和力并在细胞共定位实验中抑制KRIT1招募至HEG1；HNA为KRIT1 Lys720选择性可逆共价配体，取代HNA类似物显示改善的靶点结合与细胞活性；HN1的IC₅₀（3.51 ± 0.14 μM）处于已知HKi抑制剂的低微摩尔范围，但实验设计差异及HN1缺乏直接靶点结合与细胞研究，不能声称优效性或等效性，HN1应视为需进一步验证的初步类似物。

讨论部分总结：研究采用分层计算工作流程结合实验竞争实验，对2-羟基-1-萘甲醛衍生物进行HEG1–KRIT1 PPI干扰剂筛选，计算预测与实验结果在HN1上呈现一致性，即HN1为唯一正ΔΔG_PPI且体外IC₅₀数值最低的候选物；HN2和HN3虽显示有利的KRIT1结合与配体接触谱，但PPI能量分析提示界面稳定化且体外抑制效力较低，说明稳定结合不等于有效竞争性干扰。研究同时指出轨迹来源的发现应描述性解读为配体依赖性界面调控的近似指标，而非PPI削弱或稳定化的确证证据；MM/PBSA值仅为近似相对估计，未进行独立重复自由能计算，未赋予ΔΔG_PPI统计学显著性；IC₅₀数值差异为描述性，未进行优效性或等效性正式统计检验；ADMET预测提示早期类药性可接受但存在毒性与反应性隐患。研究结论部分翻译如下：本研究筛选了2-羟基-1-萘甲醛衍生物聚焦库，以鉴定HEG1–KRIT1蛋白–蛋白相互作用这一CCM信号调控界面的候选小分子调节剂。整合类药性过滤、对接、MD精修、基于MM/PBSA的能量分析、自由能景观评估和ADMET谱分析的分步计算工作流程优先产出HN1–HN3用于实验检测。对接与MD分析提示三个化合物均可占据KRIT1 FERM结构域的HEG1识别区域并在模拟轨迹中维持与KRIT1的相互作用。计算的PPI指标显示配体依赖性差异：HN1给出适度正ΔΔG_PPI估计值及若干天然界面指标变化，而HN2和HN3给出负ΔΔG_PPI估计值及更符合改变或扩展界面堆积的相互作用模式；这些轨迹来源发现应描述性解读为配体依赖性界面调控的近似指标，而非PPI削弱或稳定化的确证证据。在基于微珠的流式细胞术竞争实验中，三个化合物均浓度依赖性降低EGFP–KRIT1 FERM与HEG1包被微珠的结合。HN1的IC₅₀估计值为3.51 ± 0.14 μM，在相同实验条件下与HKi2的3.90 ± 0.13 μM估计值数值相近，而HN2和HN3的IC₅₀估计值更高；这些数值差异为描述性，不能确立化合物间优效性或等效性。ADMET预测提示总体可接受的早期类药性特征，但也识别出需进一步研究的潜在毒性与反应性隐患。总体而言，计算与实验结果支持HN1作为初步筛选命中物、2-羟基-1-萘甲醛骨架作为进一步优化的潜在起点。需额外研究确认直接KRIT1结合、评估选择性与非特异性反应性、用正交生化与细胞实验确立活性，并确定HN1对KLF2和KLF4等下游CCM信号标志物的影响。