《Emerging Microbes & Infections》：Development of an accurate CRISPR/Cas13 diagnostic system for Wuchereria bancrofti
编辑推荐：
疾病监测对世界卫生组织（World Health Organization, WHO）全球消除淋巴丝虫病（Lymphatic Filariasis, LF）规划至关重要，但目前适用于现场（field-ready）的诊断工具在低流行区（low-endemic s
疾病监测对世界卫生组织（World Health Organization, WHO）全球消除淋巴丝虫病（Lymphatic Filariasis, LF）规划至关重要，但目前适用于现场（field-ready）的诊断工具在低流行区（low-endemic settings）表现出灵敏度和/或特异性不足。研究人员旨在开发一种超灵敏且适用于现场的基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）工具，用于Wuchereria bancrofti感染的即时检测（point-of-care, POC）。该SHERLOCK检测将重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）与CRISPR/Cas13a检测相结合，分别以两步法（two-step）和一锅法（one-pot）两种格式进行，其灵敏度与qPCR（新兴金标准）进行比较。W. bancrofti SHERLOCK检测实现了0.1 fg/μL gBlock DNA的检测限，且与另外5种丝虫物种无交叉反应。该检测使用来自萨摩亚（Samoa）的149份蚊媒混合样本和185份人血液样本进行验证，这些样本此前已采用世界卫生组织推荐的丝虫病检测试纸条（Filariasis Test Strips, FTS）进行了LF抗原检测，并通过显微镜检查了微丝蚴（microfilariae, Mf）。对于蚊媒和人血液样本，两步法SHERLOCK检测均达到100%的灵敏度和特异性，而一锅法SHERLOCK显示出94.0-96.4%的灵敏度和100%的特异性。为提高该检测的现场部署能力，研究人员还使用了冻干（lyophilised）一锅法SHERLOCK主反应体系，并评估其在25°C、4°C和-20°C保存后的热稳定性。冻干一锅法SHER洛克混合物在25°C保存10天后仍保持10 fg/μL W. bancrofti gBlock的检测限，表明其对试剂储存和运输的冷链（cold-chain）依赖降低。然而，当使用冻干SHERLOCK检测人血液样本时，观察到灵敏度降低（59.7%）。该基于CRISPR的平台为LF诊断提供了一种有前景的、可随时投入现场使用的下一代方法，有望解决当前局限，增强监测与消除工作。
淋巴丝虫病（Lymphatic Filariasis, LF）是一种由蚊媒传播的寄生虫病，全球逾1.2亿人口受累，其中约90%的病例由班氏吴策线虫（Wuchereria bancrofti）感染所致。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）主导的消除淋巴丝虫病全球规划已通过多轮年度大规模药物化疗（mass drug administration, MDA）覆盖逾9.43亿人，取得重大进展。然而，随着传播水平下降及消除目标临近，现有诊断手段在低流行度环境下的灵敏度与特异性不足问题日益凸显。当前三类常规工具均存在局限：其一，免疫学检测（如丝虫病检测试纸条Filariasis Test Strip, FTS）操作简便且适于现场，但循环丝虫抗原（circulating filarial antigen, CFA）在虫体清除后可持续数月甚至数年，无法区分活动性感染与既往感染，且在低传播区灵敏度下降，并可能与其他蠕虫产生交叉反应而导致假阳性，从而低估MDA对传输的真实影响。其二，外周血显微镜检测微丝蚴（microfilariae, Mf）劳动密集、灵敏度低，且受昼夜周期性影响（多数地区需夜间采血），在操作上具有挑战性，易造成感染率低估，使残余感染持续存在。其三，实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）及分子xenomonitoring（MX）虽灵敏度和特异性高，却依赖专业实验设备与技术力量，难以在资源有限地区普及。
为应对上述挑战，基于成簇规律间隔短回文重复序列及相关序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）的核酸检测技术应运而生。其中，CRISPR/Cas13介导的SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）平台已应用于疟原虫、锥虫、血吸虫等多种病原体检测，并展现出单碱基分辨能力、可在37°C等温条件下完成、且无需昂贵设备的优势，为现场即时检测（point-of-care, POC）提供了新路径。尽管如此，目前针对W. bancrofti的高精度、现场友好型CRISPR诊断系统仍属空白。
鉴于此，研究人员旨在开发并验证一种基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK检测系统，涵盖两步法（two-step）与一锅法（one-pot）两种反应模式，用于在萨摩亚（Samoa）这一仍存在本土传播的流行区，对W. bancrofti感染进行现场化、超灵敏检测，并与qPCR、FTS及Mf检测进行性能比对，评估其作为下一代现场诊断工具的潜力。本研究表明，所构建的检测平台可在实现与qPCR相当灵敏度的同时具备高度现场适用性，为资源有限地区的LF监测与消除工作提供了有力的技术支撑。
研究人员采用CRISPR/Cas13a（LwCas13a）SHERLOCK平台，靶向W. bancrofti高拷贝串联重复序列#1（Tandem Repeat #1, WbTR1）设计RPA引物与crRNA，经37°C等温RPA预扩增、T7转录、Cas13a-crRNA激活附带切割（collateral cleavage）降解FAM标记探针。样本源自萨摩亚（Samoa）2023年SaMELFS项目的149份蚊媒混合样本（60份qPCR阳性、89份阴性）及185份人血液样本（67份阳性、118份阴性），以qPCR为参考平行行FTS与Mf检测。体系分液体两步法、一锅法及含5%蔗糖、150 mM甘露醇的冻干（lyophilised）一锅法，于室温（RT）、4°C、-20°C评估稳定性，并计算灵敏度、特异性、符合率及Cohen's kappa值。
**Detection limitations of W. bancrofti SHERLOCK (Two-step and One-pot) assay and cross-reactivity with other filarial species**
研究人员通过梯度稀释的W. bancrofti gBlock DNA证实，qPCR、两步法与一锅法SHERLOCK具有相同检测限（limit of detection, LoD），低至0.05 fg/μL；对Dirofilaria asiatica、Stephanofilaria spp.与Onchocerca gibsoni混合感染、O. lupi、D. repens及D. immitis五种丝虫DNA的检测显示无可测交叉反应，结合WormBase的BLAST分析，证实WbTR1正向引物可跨越W. bancrofti与近缘Brugia属间的全部核苷酸变异位点，赋予该检测高度种特异性。
**Evaluation of the W. bancrofti SHERLOCK (Two-step and One-pot) assay against qPCR using pooled mosquito samples**
在149份蚊媒混合DNA样本中，两步法SHERLOCK对60份qPCR阳性样本全部检出，对89份阴性样本全部排除，灵敏度与特异性均为100%；一锅法SHERLOCK因5份样本DNA量不足被排除后，对剩余55份qPCR阳性样本检出53份（灵敏度96.4%），特异性100%。两种方法与qPCR的符合率分别达1.00与0.99，背景扣除荧光（background-subtracted fluorescence, BSF）值呈双峰分布，提示阴阳性样本可被明确区分。
**Evaluation of the W. bancrofti SHERLOCK (Two-step and One-pot) assay against qPCR using human blood samples with known Ag and Mf status**
在185份人血液样本（67份qPCR阳性、118份随机阴性）中，两步法SHERLOCK灵敏度与特异性均为100%；一锅法SHERLOCK灵敏度为94.0%（63/67），特异性100%。与Mf检测相比，两步法灵敏度94.2%，一锅法89.9%，两者特异性均为100%，符合率分别为0.98与0.96。结果显示，461份人血样本中203份FTS阳性，但仅65份为Mf阳性，而qPCR仅检出67份阳性，提示大量FTS阳性样本可能并非活动性感染。
**Freeze-dried one-pot W. bancrofti SHERLOCK assay development and testing**
研究人员制备两版冻干一锅法主反应体系：基础版（v.1）与添加5%蔗糖、150 mM甘露醇的优化版（v.2）。稳定性研究显示，v.2在-20°C或4°C保存20天、室温（RT）保存10天后，仍可检测100 fg/μL与10 fg/μL gBlock DNA；而v.1在4°C或RT下保存5-10天后即失去检测低浓度靶标的能力。然而，以-20°C保存5天的v.2冻干试剂检测97份人血液样本（67份qPCR阳性、30份阴性），灵敏度仅为59.7%（40/67），特异性100%，提示冻干体系对人源样本的适用性仍需优化。
**Statistical analysis for SHERLOCK assays compared to qPCR using human and mosquito samples**
综合统计表明，两步法SHERLOCK与qPCR在所有样本类别（蚊媒、人血，及按Ag、Mf状态分层）中达到完美一致（灵敏度、特异性、符合率与kappa值均为1.00）；一锅法SHERLOCK灵敏度略低（人样本0.94，蚊媒0.96），冻干一锅法则因灵敏度下降导致kappa值降低。三种SHERLOCK检测对所有Mf阴性样本均呈阴性结果。
研究人员在讨论中指出，本研究开发的CRISPR/Cas13基W. bancrofti检测展现了作为下一代现场诊断工具的强大潜力。在成本方面，包含DNA提取在内，两步法SHERLOCK每样本约AU$9.10，一锅法AU$11.30，冻干一锅法AU$10.00，qPCR为AU$7.10，FTS横向流检测为AU$10.00；尽管qPCR试剂成本最低，但其依赖昂贵的实时荧光PCR仪及专业实验室基础设施，而SHERLOCK仅需37°C恒温装置，并可进一步与手持式紫外灯或侧向流试纸条（lateral-flow strips）结合，在成本、分析性能与现场适用性之间实现有效平衡。一锅法灵敏度略低于两步法，推测源于RPA扩增、T7转录与Cas13检测在同一反应体系中的兼容性限制，而非Cas13检测本身的内在缺陷；通过调控缓冲液组成、Mg2?浓度及引物浓度等参数，有望改善一锅法性能。
冻干技术的应用显著降低了对超低温冰箱及冷链储运的依赖，含蔗糖/甘露醇的v.2配方在室温（RT）下10天仍保持活性，增强了试剂的现场部署能力；但人血液样本检测中观察到的灵敏度下降（59.7%）表明，冻干体系的活性与稳定性仍需进一步提升。未来可通过甘氨酸/精氨酸等化学稳定剂优化冻干工艺，采用2'-O-甲基修饰crRNA或锁核酸（locked nucleic acids）提升核酸酶抗性与热稳定性，或替换为热稳定性Cas酶（如来源于Thermoclostridium caenicola的TccCas13a或Brevibacillus sp.的BrCas12b），以增强高温环境下的耐受能力。
与FTS的比较凸显了SHERLOCK在活动性感染判别中的优势：由于CFA在虫体清除后可长期存在，本研究仅观察到33%的FTS阳性样本被两步法SHERLOCK或qPCR检出，提示其余FTS阳性可能代表早期或已治愈感染；此外，W. bancrofti SHERLOCK与D. repens及O. lupi无交叉反应，而FTS已知可与Loa loa等产生交叉反应。SHERLOCK与Mf检测具有0.96–0.98的高度符合率，支持Mf作为活动性感染可靠指标的价值。
综上所述，本研究所建立的W. bancrofti SHERLOCK检测平台兼具超灵敏、高特异与现场友好特性，为资源有限地区提供了连接实验室级qPCR与简易FTS横向流检测之间的实用桥梁。该平台有望满足WHO对快速线虫制图的迫切需求，强化监测与评价项目，特别是在消除LF的后MDA阶段，为识别残余感染与传播热点、巩固全球消除成果提供关键技术支撑。
