基于N端定点PEG化改造的IFN-α2-EIFK变异体在慢性乙型肝炎中展现优于PEG-IFN-α2的抗HBV与免疫调节效能

《Emerging Microbes & Infections》：A Biologically Optimized PEG-IFN-α2 Variant Exhibits Potent Anti-HBV and Immunomodulatory Efficacy

　　

人干扰素-α（IFN-α）包含13种亚型，但仅IFN-α2（a/b）获批用于慢性乙型肝炎（CHB）治疗，其应用受不良反应与应答率欠佳所限。此前，研究人员鉴定出IFN-α14是抗HBV活性优于IFN-α2的亚型，并据此通过受体结合位点的靶向突变构建了IFN-α2-EIFK变异体，以模拟IFN-α14增强的抗病毒活性。然而，受血浆半衰期短及缺乏适用于评价人IFN-α活性的免疫健全小鼠系统的限制，IFN-α2-EIFK的体内抗HBV效应尚未被探索。研究人员利用免疫健全的IFNAR-hEC小鼠模型及HBV感染的人肝嵌合小鼠等，证明N端PEG化的IFN-α2-EIFK（PEG-IFN-α2-EIFK）在等质量剂量下对HBV复制与抗原表达的抑制效果较PEG-IFN-α2强约10倍，同时在肝细胞与免疫细胞中激活类IFN-γ（IFN-γ）信号通路。随后对IFNAR-hEC小鼠肝内免疫细胞的单细胞分析显示，PEG-IFN-α2-EIFK与巨噬细胞、树突状细胞（DCs）及B细胞抗原提呈能力增强相关。此外，PEG-IFN-α2-EIFK被发现在促进M1样巨噬细胞极化、调节巨噬细胞与CD8+T细胞间PD-L1/PD-1相互作用方面具有优先作用，并伴随耗竭相关CD8+T细胞状态的减弱。总之，该研究表明PEG-IFN-α2-EIFK在等质量剂量下较PEG-IFN-α2具有更强的抗HBV活性与免疫调节效能，支持其作为CHB强化治疗候选药物的潜力。

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大公共卫生挑战，据世界卫生组织（WHO）估计，2022年全球约2.54亿人存在慢性HBV感染，每年因肝硬化、肝细胞癌（HCC）等并发症死亡约110万人。目前CHB临床管理主要依赖核苷（酸）类似物（NAs）与干扰素-α（IFN-α）。NAs通过抑制病毒逆转录酶强效抑制HBV复制、降低病毒载量，但需长期甚至终身给药，停药后复发率高。IFN-α作为兼具抗病毒与免疫调节双重功能的天然细胞因子，可实现持续性抗原下降、疗程有限，并已被证明可通过表观遗传修饰共价闭合环状DNA（cccDNA）促进HBV转录沉默。然而，IFN-α的临床应用受明显不良反应及部分人群应答率欠佳的限制，亟需改进的IFN治疗策略。

人IFN-α有13种亚型，尽管共享保守序列并共同经IFNAR1/IFNAR2受体信号转导，各亚型在抗病毒强度与免疫调节活性上存在功能异质性。研究人员此前发现IFN-α14是最强效亚型，在细胞模型与HBV感染人肝嵌合小鼠模型中均显示更强的HBV复制抑制，机制在于其更强的IFNAR1结合亲和力，可协同激活I型与II型信号通路并更广泛诱导抗病毒效应因子。据此，研究人员在IFNAR1结合界面的关键氨基酸位点（83、87、90、121）进行替换，理性构建了IFN-α2-EIFK变异体，重现了IFN-α14的高效能。但IFN-α2-EIFK的体内抗HBV效应评价受限于缺乏免疫健全小鼠模型——小鼠与人IFNAR1/IFNAR2序列同源性仅50–51%，野生型小鼠对人I型IFN反应低下。为此，研究人员采用一种在保留完整适应性免疫系统同时具备功能性人IFNAR信号的新型小鼠模型，得以直接比较IFN-α2-EIFK与IFN-α2的抗HBV效能与宿主免疫调节作用。此外，重组IFN-α的临床应用受血浆半衰期短、生物利用度低所限，PEG化（聚乙二醇共价偶联）可通过增大流体力学体积延长循环时间，使PEG-IFN-α成为CHB标准治疗之一。本研究采用含硫酯的PEG分子，经自然化学连接策略定点偶联至IFN-α变异体N端，较随机PEG化更能保留生物活性并提高产物均一性。为解析免疫调节机制，研究人员整合单细胞RNA测序（scRNA-seq），进一步刻画亚型特异性免疫细胞调控、鉴定关键抗病毒决定因素并阐明各变异体活性差异的机制基础。

研究结果显示：

PEG-IFN-α2-EIFK保留增强的生物活性并在肝细胞中同时激活I型与II型干扰素信号。研究人员将40 kDa含硫酯PEG分子经自然化学连接偶联至IFN-α N端半胱氨酸，氧化还原条件下折叠并表征；野生型小鼠皮下注射30 μg/kg后，PEG-IFN-α2-EIFK半衰期超过50小时，提示长效修饰成功。在人肝癌细胞系中，PEG-IFN-α2-EIFK较PEG-IFN-α2诱导更强、剂量依赖的STAT1、STAT2、STAT3磷酸化，并引起更高水平的干扰素刺激基因（ISGs）表达；在原代小鼠肝细胞（PMH）中亦获证实。值得注意的是，除促进经典STAT1:STAT2异二聚体外，PEG-IFN-α2-EIFK还促使STAT1:STAT1同二聚体形成，为IFN-γ通路同步激活的标志。在IFNAR-hEC小鼠体内，PEG-IFN-α2-EIFK显著提高肝脏ISGs（包括鸟苷酸结合蛋白（GBP）家族成员）表达；转录组测序显示其触发的上调差异表达基因（DEGs）约为PEG-IFN-α2的20倍；基因集富集分析（GSEA）不仅证实IFN-α通路激活更强，还显示IFN-γ信号通路显著富集。

PEG-IFN-α2-EIFK在体外与体内HBV感染模型中均表现增强的抗HBV效能。在HBV感染的HepG2-NTCP细胞模型中，以质量浓度计，PEG-IFN-α2-EIFK对HBV抗原与病毒DNA的半数抑制浓度（IC₅₀）约低10–20倍，并显著降低胞内核心颗粒DNA与HBV RNA水平，且对A–D基因型HBV抗原产生均有抑制，提示其抗病毒活性不限于单一基因型。在HBV感染人肝嵌合小鼠中，等质量剂量下PEG-IFN-α2-EIFK对血清HBV抗原与病毒DNA的抑制显著更强；治疗4周后，低剂量（5 μg/kg）PEG-IFN-α2-EIFK所达到的血清HBV抗原与DNA下降幅度，与五倍高剂量（25 μg/kg）PEG-IFN-α2相当。此外，PEG-IFN-α2-EIFK对肝内HBsAg、HBcAg、HBV RNA及cccDNA的降低均显著大于PEG-IFN-α2；主要脏器大体检查与肝组织H&E染色未见与治疗相关的异常。

PEG-IFN-α2-EIFK的免疫细胞激活效能优于PEG-IFN-α2。在CD45⁺小鼠免疫细胞中，PEG-IFN-α2-EIFK诱导更强、剂量依赖的STAT蛋白磷酸化与ISGs转录上调，并同样检测到STAT1:STAT1同二聚体。IFNAR-hEC小鼠体内评价显示，PEG-IFN-α2-EIFK皮下给药后CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞及NK细胞活化标志物CD69上调更明显；脾脏CD8⁺T细胞经体外PMA/离子霉素刺激后产生更高水平IFN-γ；CD8⁺T细胞增殖标志物Ki-67表达及树突状细胞（DCs）共刺激分子CD86水平亦显著提高。在卵清蛋白（OVA）特异性CD8⁺T细胞应答中，PEG-IFN-α2-EIFK较PEG-IFN-α2更有效地提高抗原特异性细胞频率、IFN-γ分泌与细胞毒活性。

PEG-IFN-α2-EIFK在慢性HBV模型中改善病毒学控制与肝内免疫应答。研究人员以rAAV8-HBV1.3接种IFNAR-hEC小鼠，按基线血清HBV抗原水平分层，各组皮下给药（30 μg/kg，每周两次）12周。该剂量下两种PEG-IFN-α制剂重复给药耐受良好，外周血细胞计数（WBC、RBC、PLT）、血清转氨酶（ALT、AST）及肝组织学未见显著变化。12周内PEG-IFN-α2-EIFK对血清HBV抗原的降低显著大于PEG-IFN-α2；至第12周，PEG-IFN-α2-EIFK组有4只小鼠血清HBsAg低于10 IU/mL，其中2只出现可检测的HBsAb血清学转换。PEG-IFN-α2-EIFK同样更有效降低肝内病毒储存库，肝内HBV RNA与HBcAg显著更低。纵向ALT监测显示PEG-IFN-α2-EIFK治疗早期出现轻度、一过性升高，后期组间无显著差异。免疫组化显示PEG-IFN-α2-EIFK组肝内CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞浸润显著增多，与局部免疫激活增强一致。

PEG-IFN-α2-EIFK调节PD-L1/PD-1信号并减弱耗竭相关CD8⁺T细胞状态。研究人员对肝内免疫细胞行scRNA-seq，将CD8⁺T细胞分为初始/记忆（T_n/T_m）、效应（T_eff）、增殖性过渡效应（T_eff.Mki67）与耗竭（T_ex）四群。慢性HBV抗原暴露下T_ex亚群随时间增加，而12周PEG-IFN-α2-EIFK方案显著降低T_ex比例；T_ex簇富集Pdcd1与Cxcr6，而Tgfb1与Crem未见优先富集。配体-受体互作分析显示，经Cd274（PD-L1）–Pdcd1（PD-1）的巨噬细胞至CD8⁺T细胞互作在治疗后第12周显著增强；PEG-IFN-α2-EIFK治疗与巨噬细胞PD-L1（Cd274）表达降低及该互作减弱相关。

PEG-IFN-α2-EIFK优先驱动M1样巨噬细胞极化。通路评分提示长期PEG-IFN-α2-EIFK治疗与M1样巨噬细胞表型相关；体外实验中，PEG-IFN-α2-EIFK选择性上调PMA分化的THP-1巨噬细胞M1相关标志物（CD86、CD16、IL-12），而不显著改变M2标志物CD206；并诱导STAT蛋白磷酸化增强及STAT1:STAT1同二聚体形成。

PEG-IFN-α2-EIFK增强DCs与巨噬细胞的抗原提呈相关程序。治疗12周后，PEG-IFN-α2-EIFK较PEG-IFN-α2显著扩增CD11c⁺DCs与F4/80⁺巨噬细胞。KEGG通路分析显示第2周各组活性相当，而第12周PBS组与PEG-IFN-α2组抗原提呈相关通路活性下降，PEG-IFN-α2-EIFK组在DCs与巨噬细胞中均维持较高活性；关键抗原提呈相关基因H2-D1、H2-Aa、H2-Ab1与Cd74在该组上调，肝内CD86表达亦升高。对B细胞的分析显示，两种PEG-IFN-α变异体均降低B细胞总体数量，但PEG-IFN-α2-EIFK在第12周维持B细胞较高的抗原提呈相关通路活性，并伴浆细胞增加。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：一是采用原核表达纯化重组IFN-α蛋白，并以含硫酯的40 kDa PEG分子经自然化学连接实现N端定点PEG化，随后在氧化还原条件下折叠与表征；二是使用两类体内模型，即HBV感染人肝嵌合小鼠（HBV-Hu-URG，来源于北京维通达生物技术有限公司，由原代人肝细胞移植入多西环素诱导的URG小鼠肝脏后感染A基因型HBV）与I型干扰素受体胞外域人源化（IFNAR-hEC）小鼠（经rAAV8-HBV1.3静脉接种），另设OVA免疫模型；三是分子与病毒学检测，包括蛋白质印迹（Western blot）、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）、Northern blot与Southern blot、ELISA、实时PCR及免疫组化/免疫荧光；四是转录组与单细胞水平分析，包括肝组织批量RNA测序（Illumina NovaSeq 6000平台）与基于10X Genomics Chromium平台的单细胞RNA测序（scRNA-seq），并配合流式细胞术与GSEA、KEGG等生物信息学分析。

讨论部分指出，尽管IFN-α家族具有多样性，CHB临床用药仍限于IFN-α2；本研究构建并表征了模拟IFN-α14高效能的IFN-α2-EIFK变异体，比较研究确立了PEG-IFN-α2-EIFK更优的抗HBV效能与更强的免疫调节作用。早期未修饰重组IFN-α受半衰期短、生物利用度低与疗效欠佳限制，已有PAS多肽融合、抗VEGFR2融合及PEG修饰等延长半衰期的策略；PEG偶联可增大分子量、延长半衰期，方式可为随机或定点。本研究采用定点修饰策略，将PEG经双功能连接子偶联至远离活性中心的N端半胱氨酸，以便稳健比较不同IFN-α变异体的体内抗病毒免疫应答；人肝癌细胞系与IFNAR-hEC小鼠的功能研究进一步表明PEG-IFN-α2-EIFK保留生物活性并在体内外发挥抗病毒作用。

在直接抗病毒活性方面，PEG-IFN-α2-EIFK在多个实验模型中表现更优，可降低肝人源化小鼠肝内HBV cccDNA水平，并伴HBV RNA与病毒抗原下降，与IFN-α信号抑制cccDNA转录的既有认识一致；但其是否直接改变cccDNA表观遗传状态尚待研究。rAAV-HBV模型中部分小鼠血清HBsAg显著下降而HBeAg仍可检出，与两种病毒标志物的动力学差异及该模型既往观察一致，故HBsAg下降应解释为抗原的实质性抑制而非HBV彻底清除，HBsAg与HBeAg为互补的病毒学终点。

在免疫调节方面，慢性HBV感染建立以持续病毒抗原抑制肝内免疫为特征的免疫耐受微环境，表现为DCs抗原提呈与迁移受损、巨噬细胞促炎极化减弱、B细胞抗体应答迟钝；标准PEG-IFN-α2治疗可部分逆转其中部分缺陷，但广泛而持久的免疫恢复作用有限。鉴于IFN-α2-EIFK独特激活类IFN-γ信号，而IFN-γ可通过上调MHC I强效增强抗原提呈，研究人员推测PEG-IFN-α2-EIFK能更有效调节抗原提呈细胞（APC）功能；长期治疗确实维持肝脏巨噬细胞与DCs浸润，并与这些细胞抗原提呈相关转录程序富集相关；两种PEG化变异体均降低B细胞总数，但仅PEG-IFN-α2-EIFK保留B细胞抗原提呈功能。不过这些数据主要提示髓系细胞丰度与转录状态变化，并未直接证实DCs与巨噬细胞功能性抗原提呈增强；受单细胞数据中肝细胞代表性有限所限，PEG-IFN-α2-EIFK对肝细胞驱动抗原提呈的直接作用未能评估。

关于CD8⁺T细胞，12周PEG-IFN-α2-EIFK方案后耗竭CD8⁺T细胞显著减少，配体-受体互作分析提示T_ex减少与CD8⁺T细胞PD-1与巨噬细胞PD-L1相关互作改变存在关联，这与PD-L1⁺巨噬细胞作为CD8⁺T细胞功能障碍相关免疫调节组分的既往研究一致；PEG-IFN-α2-EIFK同时降低PD-L1⁺巨噬细胞频率并促其M1样极化，而后者与免疫抑制能力减弱相关。慢性HBV感染形成免疫抑制的M2优势环境，标准IFN-α治疗还可能上调PD-L1，而IFN-γ促进免疫原性M1极化；研究结果支持PEG-IFN-α2-EIFK治疗与巨噬细胞重编程相关，但类IFN-γ信号是否参与该轴及其确切机制尚未明确，PEG-IFN-α2-EIFK是直接抑制PD-L1转录还是经重塑的细胞因子网络间接作用，尚需后续研究。近期研究提示慢性HBV感染中功能失调CD8⁺T细胞存在显著异质性，包括超越经典耗竭框架的效应减弱与CXCR6⁺功能失调状态；本研究总CD8⁺T细胞scRNA-seq数据中T_ex群富集Pdcd1与Cxcr6，与耗竭相关状态及慢性HBV感染中CXCR6相关功能失调状态特征相符；但由于分析基于总CD8⁺T细胞而非HBV特异性CD8⁺T细胞，这些转录组特征不能用于界定HBV特异性CD8⁺T细胞的功能状态，T_ex减少应解释为更广泛肝脏免疫应答中耗竭相关CD8⁺T细胞状态的减弱，而非HBV特异性CD8⁺T细胞功能障碍的确定性逆转。

研究结论（译文）：总之，本研究在多个实验模型中证明新型长效干扰素-α变异体PEG-IFN-α2-EIFK具有增强的抗HBV效能。除证实研究人员此前发现的IFN-α2-EIFK协同激活IFN-I与IFN-γ信号的能力外，本研究进一步刻画其免疫调节特征，包括肝脏APC抗原提呈相关程序的持续改变、巨噬细胞向M1样促炎表型的重编程，以及伴随耗竭相关CD8⁺T细胞状态减弱的PD-L1/PD-1检查点轴的协同变化。这些发现共同支持如下模型：PEG-IFN-α2-EIFK在发挥增强的直接抗病毒活性的同时产生更广泛的免疫调节效应，支持其作为CHB潜在治疗策略的进一步开发。作者同时指出研究局限：IFNAR-hEC小鼠模型仅人源化IFNAR胞外域，下游信号组分与免疫细胞仍为鼠源，所观察的抗病毒与免疫表型可能无法完全再现人体应答，需在人源系统中进一步验证；巨噬细胞、树突状细胞及HBV特异性CD8⁺T细胞对PEG-IFN-α2-EIFK抗病毒效能的直接功能贡献尚待确立，需进一步功能研究阐明其增强抗病毒效应的机制。