中国2024—2025年Clade 2.3.4.4b H5病毒G2衍生新兴簇（G2-EC）的出现及其快速进化与抗原性分化

《Emerging Microbes & Infections》：Emergence of a Distinct Evolutionary Cluster of Clade 2.3.4.4b H5 Viruses in China during 2024-2025 with Rapid Evolution and Antigenic Divergence

　　

Clade 2.3.4.4b H5病毒自在中国出现以来持续进化，但近期流行病毒的遗传和抗原性多样化程度仍不清楚。研究人员对2024—2025年中国常规监测中分离的18株H5病毒进行了表征，并结合2020年以来公开可获得的Clade 2.3.4.4b H5序列。系统发育分析显示，这些分离株在Clade 2.3.4.4b内形成一个独特的进化簇，命名为G2衍生新兴簇（G2-EC），该簇约于2024年中期出现，并与既往流行的H5N1病毒存在明显遗传分化。G2-EC病毒积累了一组特征性血凝素（HA）氨基酸替换，其中大多数位于抗原区域。在整个Clade 2.3.4.4b H5病毒群体中，2024—2025年估计的平均HA进化速率高于此前时期。这些遗传变化伴随与Re14疫苗株的显著抗原性分化，血凝抑制（HI）滴度降低4—32倍。基因组分析显示，G2-EC H5N1病毒从不同遗传背景获得PB1片段（PB1），随后出现共享高度相似遗传骨架但携带不同神经氨酸酶（NA）片段的H5N6病毒，提示序贯重配。动物实验显示，代表性G2-EC病毒在无特定病原体（SPF）鸡中保持高致病性和高效直接接触传播，而在小鼠中致死性相对有限。综上，这些发现记录了2024—2025年中国Clade 2.3.4.4b H5病毒的近期进化转变，其特征为遗传和抗原性分化伴随序贯重配，强调需要持续进行基因组和抗原性监测。

自A/Goose/Guangdong/1/1996（Gs/GD/96）出现以来，H5高致病性禽流感病毒（HPAIV，引起禽类高致死性的A型流感病毒）持续进化和全球传播，给养禽业造成经济损失并构成公共卫生威胁。Clade 2.3.4.4b已成为近年全球主要流行谱系，广泛分布于亚洲、欧洲、非洲和美洲，并多次突破种间屏障感染狐狸、水貂、海狮、海豹及美国奶牛等哺乳动物。血凝素（HA，流感病毒主要表面糖蛋白）是宿主中和抗体主要靶标，HA免疫相关位点氨基酸替换可改变抗原表型，通过抗原漂移削弱既有免疫并赋予变异株传播优势。Wang et al.报道单个氨基酸替换即可显著改变抗原性，如H5-Re13中A83 V和H5-Re14中A83D降低疫苗抗血清交叉反应；Li et al.显示HA抗原位点B的205和208位联合替换是Clade 2.3.4.4亚群H5Nx抗原漂移关键决定因素；Feng Wen et al.报道H5N1 HA的D158N和N193 K增强α-2,6-唾液酸受体结合。中国全国H5疫苗免疫显著降低发病和传播，但持续免疫压力可能选择抗原变异株，及时识别新抗原变异株和更新疫苗株至关重要。尽管中国Clade 2.3.4.4b H5病毒遗传多样性已有较多记录，近期新出现病毒是否在遗传组成、抗原表型和生物学特性上发生更广泛进化仍不清楚。为此，研究人员于2024—2025年开展系统监测和综合表征。

研究人员对2024—2025年中国常规监测分离的18株H5病毒（15株H5N1和3株H5N6）及公共数据库序列进行系统发育、分子进化、抗原性和动物实验分析，发现Clade 2.3.4.4b内出现G2衍生新兴簇（G2-EC），其HA积累特征性替换、进化速率升高并与Re14疫苗株明显抗原分化；G2-EC H5N1获得不同PB1片段后又出现携带不同NA片段的H5N6，提示序贯重配；代表性病毒在SPF鸡中保持高致病性和高效接触传播，在小鼠中致死性相对有限。该研究记录了中国Clade 2.3.4.4b H5病毒近期遗传和抗原性分化及重配的进化转变，强调持续基因组和抗原监测对疫苗株评价和风险评估的重要意义。

关键技术方法（不超过250字）：2024年10月至2025年10月在中国多地区农场、兽医诊所和活禽市场（LPMs）采集8,674份样本，分离18株H5病毒；结合GISAID和NCBI中2020—2025年中国Clade 2.3.4.4b H5 HA序列及2022—2025年全球序列。采用病毒分离与全基因组测序；MAFFT比对、IQ-TREE最大似然（ML）系统发育分析、TempEst时间信号评估、BEAST贝叶斯最大分支可信度（MCC）树和进化速率估计；HA同源建模和残基保守性分析；血凝抑制（HI）试验和抗原图（antigenic cartography，基于HI滴度可视化抗原距离）；SPF鸡和BALB/c小鼠动物实验。

研究结果：（1）Phylogenetic analysis of HA genes of clade 2.3.4.4b viruses circulating in China：基于2020年以来中国210株H5Nx及本研究18株HA基因最大似然树，分离株HA核苷酸同一性98.8%—99.8%，在Clade 2.3.4.4b内形成支持度高的单系簇，邻近2023年至2024年上半年H5N1但已明显遗传分化；MCC树将中国Clade 2.3.4.4b H5分为G1和G2，2024年下半年起G2内H5N1进一步形成单系亚群并成为2024—2025年G2 H5N1多数，命名为G2-EC，最近共同祖先时间（tMRCA）约2024年5月；HA核苷酸相似性随时间逐渐下降，2025年分离株与2020—2022年株相似性明显降低。（2）Global phylogenetic analysis of clade 2.3.4.4b H5N1 viruses：基于2022—2025年全球H5N1序列，2022年至2024年上半年中国H5N1与同期亚洲病毒聚集，2024年下半年后G2-EC H5N1在全球树中形成独立单系，具一致HA特征替换，主要在中国检测，除2025年11月日本环境样本少量高度相似序列外未见其他地区广泛检测。（3）Analysis of amino acid variation in the HA protein：HA分析识别15个高变位点（83、86、97、115、120、124、126、129、154、155、162、183、188、189和487，H5编号），主要位于抗原位点A和B；G2-EC H5N1相对Re14疫苗株携带10个替换：A83D、L115Q、S120N、N124D、N154D、I162R、N183D、I188 K、N189 K和D487Y，除154位在部分H5N6中变异外其余9个在所有G2-EC中一致；除162和487外均位于抗原区，部分位于球状头域和受体结合区。（4）Evolutionary rate analysis：2020—2025年HA总体平均进化速率5.948 × 10^?3 substitutions per site per year（95% HPD：5.273 × 10^?3—6.623 × 10^?3）；2020—2021、2022—2023和2024—2025年分别为5.422 × 10^?3、5.475 × 10^?3和6.783 × 10^?3，2024—2025年估计均值升高。（5）Dynamic evolution of genotypes：18株内部基因高度保守（各内部片段核苷酸同一性>98%），H5N1与H5N6在NA树中分属不同谱系；15株H5N1的PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS与既往N1.3基因型相近，PB1形成与欧亚和非洲野鸟低致病性AIV相关的独立谱系，提示在N1.3骨架上替换PB1形成新重配基因型；随后H5N6除NA与亚洲禽H6N6相关外其余片段与G2-EC H5N1高度相似，提示获得H6N6相关NA，呈序贯重配。（6）Antigenic analysis：基于14份抗血清HI试验，Re14同源HI滴度512，对2021—2023年田间病毒HI滴度256—1024（较同源不超过2倍降低），对本研究18株HI滴度16—128（降低4—32倍）；2020—2023年病毒抗血清对本研究病毒反应下降，G2-EC代表病毒抗血清与既往病毒交叉反应也下降；抗原图显示本研究18株形成与Re14及2020—2023年病毒分离的独立抗原簇，G2-EC内抗原异质性有限，B1417与G2-EC抗原关系最近，抗原进化与HA系统发育分组总体一致。（7）Pathogenicity and Transmissibility in SPF Chickens：选择3676、B90-8（H5N1）和B1240（H5N6），以10⁶ EID₅₀鼻内接种SPF鸡并接触传播；三株均致接种鸡严重疾病和快速死亡，平均死亡时间分别为56 h、48 h和48 h；接触组均见有效传播，3676和B90-8接触鸡全部死亡，B1240接触组存活1只（16.7%）；接种鸡1 dpi口咽和泄殖腔排毒，接触鸡多在接触后3天检出，3676和B90-8排毒持续至9 dpi，B1240 7 dpi后未再检出；组织滴定显示心、肝、脾、肾、十二指肠、法氏囊、脑、气管和肺广泛复制，肺滴度最高、肾次之；三株在SPF鸡中高致病并高效直接接触传播，B1240传播略弱。（8）Replication and virulence of H5 viruses in mice：三株代表病毒在小鼠中致死性相对有限，MLD₅₀分别为7.54、6.78和7.83 log₁₀EID₅₀，B90-8最低；3 dpi主要于肺和鼻甲复制，3676和B90-8部分小鼠肾检出微量病毒，心、肝、脾、肠和脑未检出；5 dpi 3676和B1240肺和鼻甲病毒载量明显下降，B90-8肺和鼻甲滴度进一步升高并脾低水平复制，显示其复制和组织播散相对增强。

讨论部分总结：原文认为G2-EC出现伴随HA遗传和抗原分化及持续基因组重配，代表Clade 2.3.4.4b H5病毒群体的持续进化转变。G2-EC HA特征替换多位于或邻近球状头抗原相关区域，A83D既往与Clade 2.3.4.4b H5抗原变化相关，A83D与其他抗原相关位点替换共同为观察到的抗原分化提供可能分子基础，但单个替换相对贡献仍未知，需反向遗传和定点突变研究。Re14抗血清与G2-EC的HI交叉反应明显下降对现有H5疫苗株抗原匹配有提示意义，但HI交叉反应下降不应直接等同于疫苗保护下降，需用代表性G2-EC病毒开展疫苗挑战研究评估现有疫苗保护效果并判断是否更新疫苗株。进化速率分析提示2024—2025年HA估计平均进化速率高于前两期，但该期可用HA序列有限，后验估计不确定性增加且不同时期95% HPD区间部分重叠，趋势仍需更大规模监测数据验证。G2-EC出现伴随PB1片段获得，该PB1与欧亚和非洲野鸟低致病性AIV相关；既往研究显示PB1重配可影响聚合酶活性、复制和传播且依赖遗传背景，但目前无直接证据表明G2-EC特定PB1谱系增强聚合酶活性、复制效率或传播力。G2-EC最初以H5N1为主，随后出现遗传骨架高度相似但携带N6片段的H5N6，提示G2-EC H5N1样病毒获得N6片段；这些H5N6保留与G2-EC H5N1密切相关的HA，可能使抗原分化HA特征在获得N6后得以保留，并提示H5N1和H5N6在中国持续共循环，不同于既往两亚型主要在分离系统发育簇中进化的流行病学模式。SPF鸡中代表病毒保持高致病性、系统性复制和高效直接接触传播，显示其在禽群中的流行潜力；小鼠中三株MLD₅₀较高、总体致死性有限，但均在呼吸道有效复制，B90-8复制和组织播散相对增强，其哺乳动物宿主生物学特性不应忽视。G2-EC病毒均未携带PB2 E627 K、D701N或T271A等哺乳动物适应替换，HA均携带189 K（H5编号），该替换既往与H5病毒受体结合特性改变包括增强α-2,6-连接唾液酸受体识别相关，另检测到其他既往与哺乳动物适应或毒力相关分子标记。水禽可能在中国H5病毒持续循环和进化中起重要生态作用，其生产系统生物安全性和疫苗覆盖率常较低，感染可呈轻微或亚临床而利于未被发现传播，自由放养水禽可促进野鸟与家禽间病毒交换和重配；本研究分离株中水禽来源占优势进一步提示水禽监测重要性。研究结论（译）：综上，这些发现记录了2024—2025年中国Clade 2.3.4.4b H5病毒近期的进化转变，其特征为遗传和抗原性分化伴随序贯重配，强调需要持续进行基因组和抗原性监测。