《BioTechniques》：A simple prestaining protocol to enhance visualization and embedding of 3D breast cancer organoids for downstream histological analysis
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源自肿瘤组织的三维患者来源类器官（PDOs）较传统二维培养是更真实的体外模型，能够保留原发肿瘤的关键特征。然而，将类器官处理用于组织学分析具有挑战性：其体积小、透明且分散于基质凝胶中，使得在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理过程中难以定位，存在样本丢失的风
源自肿瘤组织的三维患者来源类器官（PDOs）较传统二维培养是更真实的体外模型，能够保留原发肿瘤的关键特征。然而，将类器官处理用于组织学分析具有挑战性：其体积小、透明且分散于基质凝胶中，使得在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理过程中难以定位，存在样本丢失的风险。为解决此问题，研究人员开发了一种简便、经济的预染方法，使用可逆染料——结晶紫、伊红-亚甲蓝（EMB）和中性红——在包埋前对球状体和PDOs进行可视化与追踪。研究人员首先使用MDA-MB-231细胞系球状体测试染色、固定、包埋和脱色步骤，随后将该方案应用于乳腺癌PDOs。预染的三维结构在包埋和切片过程中保持可见，残留染料可通过短暂乙醇洗涤去除而不影响形态。分别针对Ki67/磷酸化ERK和CD49f/H3K27ac标志物的免疫组织化学和免疫荧光证实，预染未损害抗原检测。该方案提高了包埋准确性，减少了样本丢失，并保持了与后续组织学和免疫组织化学分析的兼容性，为处理小型三维类器官样本提供了一种实用方法。
研究背景方面，类器官是能够重现其来源组织关键结构和功能特性的三维多细胞体外系统。在乳腺癌研究中，患者来源类器官（PDOs）保留了上皮谱系复杂性，包括管腔和基底细胞群体，维持了肿瘤间异质性及临床相关分子特征，已成为模拟肿瘤生物学、研究治疗反应、识别候选生物标志物及支持个性化治疗策略的重要实验平台。然而，类器官的组织学处理存在技术挑战：其体积小、外观透明且常分布于低对比度基质（如Matrigel）中，导致在常规石蜡处理过程中难以识别和回收。定位不准确或未能定位类器官可导致切片平面不佳、结构部分缺失或样本完全丢失，进而影响免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）等下游应用，尤其当类器官来源于有限的临床材料时更为突出。既往研究虽提出了支持性基质包埋、高分辨率透明化和改良FFPE流程等方法以改善样本保留，但这些方法可能需要额外试剂、专门成像流程或增加操作复杂性。因此，开发一种简便的预染方法，在操作和包埋过程中增强可见性，同时保持形态学及与下游组织学的兼容性，具有重要实用价值。
研究人员开展了以下研究：优化了一种使用结晶紫、伊红-亚甲蓝（EMB）和中性红在石蜡包埋前进行可视化的简便高效流程。结晶紫是一种三芳基甲烷染料，通过与细胞物质结合产生强对比；中性红在酸性细胞内区室中积聚并产生均匀红色着色；EMB提供差异化对比，可增强细胞轮廓和内部结构的可视化。研究人员首先在MDA-MB-231来源球状体中评估这些染料，随后在乳腺癌PDOs中进行验证，测试了其在定位、包埋准确性、脱色效率以及与组织病理学和免疫组织化学兼容性方面的表现。研究结论表明，该预染方案提高了包埋准确性，减少了样本丢失，并保持了与后续组织学和免疫组织化学分析的兼容性，为处理小型三维类器官样本提供了实用方法。
在技术方法方面，研究使用MDA-MB-231细胞系在琼脂糖包被的培养皿中以癌症干细胞培养基形成球状体，培养长达14天；乳腺癌组织来源于SGPGIMS内分泌外科确诊的原发性乳腺癌女性患者活检组织（经机构伦理委员会批准，IEC编码：2023-107-EMP-131），经组织学确认分级和受体状态后选取三阴性乳腺癌（TNBC）样本用于类器官培养；采用酶消化法结合Matrigel穹顶培养建立PDOs；分别使用结晶紫（0.5% w/v于20%乙醇中，15分钟）、EMB（0.1%水溶液，10分钟）和中性红（0.05%工作浓度，25分钟）进行预染；经10%甲醛固定、石蜡包埋、3 μm切片；脱色采用二甲苯脱蜡后梯度乙醇（100%、70%、50%）洗涤；下游兼容性通过Ki67/磷酸化ERK1/2的IHC和CD49f/H3K27ac的IF进行验证。
研究结果方面，第一，球状体和类器官的开发：在非黏附琼脂糖包被培养条件下，MDA-MB-231细胞在接种后6–8小时内形成紧密球状体，14天培养期内体积增大并维持相对均匀的圆形形态和密集细胞组织；乳腺癌PDOs在酶消化和Matrigel培养约4天后开始出现，至第7–14天显示明确的三维结构，大小约200至600 μm，观察到实性、混合性和囊性等不同形态，与肿瘤来源培养预期的异质性一致。第二，预染改善三维结构的可视化：结晶紫、EMB和中性红均增强了球状体和类器官的可见性，明场显微镜检查显示每种染料均产生足够对比度以清晰描绘类器官边界并便于下游操作中的视觉追踪；结晶紫产生强烈紫色染色且边缘定义清晰，中性红产生均匀红色着色与背景高对比，EMB产生差异化染色突出细胞和结构特征。第三，FFPE处理和切片定位：梯度乙醇洗涤有效减少了球状体沉淀中可见残留染色，表明染料可在进一步组织学应用前去除，且脱色步骤未破坏球状体结构；结晶紫预染的类器官在甲醛固定过程中保持清晰可见，便于在溶液中识别；在转移和包埋过程中改善的对比度使三维结构更准确地放置于模具中心，包埋、脱水和切片后未观察到明显碎片或大体形态扭曲，3–4 μm切片保留了足够可见性以在载玻片上定位球状体和类器官，用钻石笔标记感兴趣区域进一步便于后续组织学操作中的识别。第四，与脱色和下游免疫染色分析的兼容性：脱色方案去除了染色石蜡切片中可见残留染料而未影响类器官和球状体的整体结构完整性；结晶紫预染的类器官切片经Ki-67 IHC评估显示增殖细胞中清晰的核染色，未检测到结晶紫预染的干扰，CD49f IF在预染和未染色类器官切片中显示可比拟的膜和细胞质定位模式；进一步评估磷酸化ERK1/2 IHC显示细胞质染色伴显著核定位，H3K27ac IF产生 distinct 核荧光且染色模式与未染色对照相当，表明结晶紫预染未可检测地干扰所测试的磷酸化或乙酰化依赖性表位的识别；使用EMB或中性红预染的类器官经相同IHC和IF标志物面板评估显示可比拟的染色模式（见补充图1）， collectively 支持结晶紫、EMB和中性红作为包埋前可视化染料与下游IHC和IF兼容，包括检测所测试的细胞内、细胞表面和翻译后修饰靶标。
讨论部分总结：本研究描述了一种实用的预染策略以改善球状体和乳腺癌PDOs在FFPE处理中的定位，所解决的核心挑战是小而透明的三维培养物在转移、包埋和切片过程中视觉可检测性差的问题。研究结果显示结晶紫、EMB和中性红均可产生足够对比度以促进包埋前三维结构的操作和位置追踪，该方法的价值在于简单的宏观和微观可追踪性而非选择性生物学标记。所用染料廉价、易于制备且与标准实验室基础设施兼容。预染步骤根据染料不同约需10–25分钟，标准化脱色程序约需10分钟（不包括脱蜡）。用钻石玻璃标记笔在脱色前标记含类器官或球状体区域有助于染料去除后识别相关区域，使下游免疫染色试剂可特异性应用于含组织区域，可能减少抗体消耗。在评估的染料中，结晶紫似乎特别有助于清晰勾勒类器官边缘，中性红提供相对均匀的内部着色，EMB提供差异化对比。由于本研究主要设计为工作流程优化实验而非定量比较分析，这些观察应被解释为实用性而非确定性性能排名。任何包埋前标记策略的主要要求是保持下游组织学兼容性，本工作流程展示了两个重要特征：残留染料可通过短暂梯度乙醇洗涤有效去除，最小化对后续染色程序的携带污染；脱色切片中Ki67和p-ERK的免疫反应性得以保留，表明预染步骤在所测试条件下未产生明显的抗原掩蔽或干扰免疫检测。此外，预染程序不影响乳腺癌类器官模型中的荧光信号检测，CD49f和H3K27ac的免疫荧光检测显示未染色和预染类器官切片中可比拟的定位模式。研究优势包括使用细胞系来源球状体和乳腺癌PDOs，允许在相对均匀的模型中进行初步工作流程优化后在临床相关异质性样本中验证；方案整合了 readily available 试剂和常规FFPE处理，避免依赖专门包埋基质或先进成像系统。癌症类器官在个性化癌症治疗和临床前药物测试中的日益增加的应用进一步强调了患者来源三维模型可靠处理和形态学评估的重要性。数字病理学的进展促进了数字化全切片图像在定量组织学分析和生物标志物识别中的应用，人工智能（AI）方法正逐步被研究用于图像处理、诊断评估、生物标志物发现和定量分析，因此当前预染方法可能为增强小类器官和球状体在FFPE处理和后续切片成像中的可追踪性和定位提供实用手段。研究局限性包括：未提供样本回收率、包埋准确性或切片效率相对于未染色对照的正式定量指标；仅评估了一种免疫组织化学标志物，可能需要更广泛的抗原面板以完全确定诊断和机制应用中的兼容性；分析仅限于乳腺癌来源三维培养，扩展到其他组织类型或不同细胞外基质组成的类器官需要额外验证；尽管所选染料在所述条件下操作上可逆，但染色去除程度可能因类器官大小、密度、固定强度和切片厚度而异。
研究结论部分翻译：该方案为类器官组织学提供了有用的技术改进，为常见处理瓶颈提供了直接解决方案，可能改善小型三维标本在FFPE制备中的保留和定向。未来工作应侧重于相对于未染色工作流程的定量基准测试、跨更广泛生物标志物面板的评估以及适应其他肿瘤类器官系统。这些改进可支持转化癌症研究和精准肿瘤学流程中类器官的更标准化病理分析。
