《Antioxidants》：Houttuynia cordata-Based Decoupled Aquaponic System Enhances Hepatic Antioxidant Defense and Modulates Brain Stress-Related Gene Expression in Nile Tilapia
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作为一种绿色水产养殖模式，鱼菜共生系统在改善养殖环境方面具有巨大潜力，但其对养殖动物的影响尚不充分明确。本研究建立了一种基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统用于尼罗罗非鱼生产。通过水质监测、血清生化分析、肝脏抗氧化评估以及脑应激相关基因表达，评估了该系统对养殖水环境
作为一种绿色水产养殖模式，鱼菜共生系统在改善养殖环境方面具有巨大潜力，但其对养殖动物的影响尚不充分明确。本研究建立了一种基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统用于尼罗罗非鱼生产。通过水质监测、血清生化分析、肝脏抗氧化评估以及脑应激相关基因表达，评估了该系统对养殖水环境和尼罗罗非鱼生理状态的影响。该系统降低了氨氮（NH4+-N）、亚硝酸盐氮（NO2--N）、总磷（TP）、高锰酸盐指数（CODMn）和悬浮物（TSS）的水平，而总氮（TN）和硫化物（S2-）的降低仅发生在特定时间点。该系统还改善了肝功能、脂质代谢和肾功能。值得注意的是，肝脏过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性升高，表明酶促抗氧化防御能力增强。在脑组织中，gad2和penk上调，而comtb和pnmt下调，提示神经调节和应激相关反应发生改变。总体而言，基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统改善了养殖水环境和尼罗罗非鱼多个方面的生理状态，特别是肝脏酶促抗氧化防御，同时调节了神经和应激相关反应。
研究背景与意义
中国水资源时空分布不均，农业用水长期面临压力。水产养殖是农业用水消耗和水污染负荷的重要来源。在高密度集约化养殖条件下，残饵、粪便和有机物分解持续向水体输入氮、磷，导致氨氮等物质累积，增加养殖废水排放的环境压力。因此，降低养殖废水污染物负荷、提高水资源利用效率是发展绿色水产养殖面临的紧迫挑战。
尼罗罗非鱼是全球重要的淡水养殖品种，也是中国主要经济鱼类之一，生长快、适应性强、养殖技术成熟。然而，罗非鱼通常采用高密度、高投饲方式养殖，仅有约21%的饲料氮和19%的饲料磷被养殖动物同化，其余大部分进入养殖水体。这些氮磷既是污染物，也是潜在的营养资源。若不有效回收利用，易在中后期导致氨氮积累和水质恶化。尽管罗非鱼对氨氮有一定耐受性，但氨氮暴露仍可引起鳃组织损伤、血清生化指标改变、抗氧化能力下降和免疫抑制。研究表明，氨氮胁迫显著上调罗非鱼炎症、凋亡和氧化应激相关基因表达，加剧病原菌感染导致的组织病理损伤和死亡率。细菌性疾病是造成罗非鱼养殖重大损失的主要原因之一。据估计，中国池塘养殖水产品每年约有15%-17%受到与水污染相关的疾病影响，产量损失约4%-6%。池塘养殖约占中国水产养殖总产量的46%，其废水管理主要依赖生态排水沟、人工湿地等生态工程措施，常需组合应用。因此，开发既能改善水质又能维持鱼类健康的生态措施，对罗非鱼健康养殖具有重要意义。
将植物栽培与水产养殖整合于鱼菜共生系统，为养殖废水生态处理和养分资源回收提供了新途径。植物通过根系吸收水中氮磷，并借助根际微生物促进污染物转化，从而在收获植物生物量的同时改善水质、促进养分循环。已有研究表明，浮床栽培空心菜可有效吸收养殖水中氮磷，降低污染物负荷，改善养殖环境，并对养殖鱼类的代谢和生理状态产生影响。番茄、黄瓜等果蔬作物也可通过鱼菜共生系统从养殖废水中回收氮磷。药用食用植物如罗勒同样能改善养殖水质并调节养殖鱼类的免疫和抗氧化功能。
鱼腥草是一种喜湿植物，兼具药用、食用和生态价值，环境适应性强、养分吸收能力高、生物量产出潜力大。此外，鱼腥草含有多种黄酮类、生物碱类和挥发性化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎等生物活性。以往研究将鱼腥草应用于水产养殖系统发现，浮床栽培鱼腥草可改善养殖水环境，并对鱼类抗氧化能力和非特异性免疫产生积极影响。作为饲料添加剂使用时，鱼腥草还能影响鱼类血清生化参数、黏膜免疫和肠道微生物群落。以往关于鱼腥草与尼罗罗非鱼的研究主要采用直接浮床栽培或饲料添加方式，关注重点在于养殖水环境以及鱼类的抗氧化和免疫应答，而将独立水培单元与循环水养殖相结合的解耦合模式及其对罗非鱼应激反应的影响仍有待进一步研究。
与传统耦合浮床系统不同，解耦合鱼菜共生系统将植物栽培与鱼类生产分离，允许植物生产和养殖单元独立管理，从而避免在同一水体中整合所带来的相互制约。已有研究表明，解耦合系统中番茄果实产量比耦合系统高36%，提示解耦合配置可能为植物生长提供更有利条件。改善的植物生长条件可能增强植物对养殖水中养分的吸收，从而降低养殖环境中污染物负荷，并可能缓解鱼类面临的环境胁迫。养殖环境的改变可引发鱼类多种生理反应，不仅涉及氧化应激和非特异性免疫，还包括脑中神经递质和神经内分泌调节。哺乳动物研究中，含鱼腥草的复方制剂已被报道可降低血清皮质酮水平，上调海马和大脑皮层脑源性神经营养因子表达，缓解应激诱导的行为障碍。然而，鱼腥草对鱼类脑部应激相关基因表达的影响，以及其在解耦合鱼菜共生系统中应用对鱼类生理状态的影响，尚不充分明确。
基于此，本研究建立了基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统，在植物栽培与水产养殖相对分离的条件下，分析该系统对养殖水环境的影响，并结合血清生化参数、肝脏抗氧化能力和脑组织应激相关基因表达，多层面评价其对尼罗罗非鱼生理状态的影响，为不同组织形式下基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统的优化和应用提供数据支撑。
主要关键技术方法
- 1.
实验系统构建与管理：设立解耦合鱼菜共生系统（实验组）和常规养殖系统（对照组），实验期60天。实验组系统由养殖池、沉淀池、硝化池、矿化池、鱼腥草水培槽及循环水系统组成。共设3个养殖池，每个有效容积6 m3。养殖池出水经公共沉淀池、硝化池、矿化池处理后，分三路分别进入对应鱼腥草水培槽，再通过虹吸装置返回各自养殖池。对照组不含鱼腥草水培单元。养殖对象为尼罗罗非鱼，初始均重约44.8 g，每池放养60尾。鱼腥草初始鲜重1.75±0.04 g/株，每槽种植60株，种植密度25株/m2。
- 2.
水质检测：每5天采集养殖池水样，现场测定水温、溶解氧（DO）和pH值。化学指标包括总氮（TN）、总磷（TP）、亚硝酸盐氮（NO2--N）、硝酸盐氮（NO3--N）、氨氮（NH4+-N）、高锰酸盐指数（CODMn）、硫化物（S2-）和总悬浮固体（TSS）。
- 3.
血清生化指标测定：在实验第20、40、60天，每池随机取3尾罗非鱼采血，分离血清后测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肌酐（CREA）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）。
- 4.
肝脏抗氧化参数测定：同期采集肝脏组织，匀浆后测定过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。
- 5.
脑组织应激相关基因表达分析：同期采集脑组织，提取RNA进行逆转录和实时定量PCR（qPCR），检测谷氨酸脱羧酶2（gad2）、儿茶酚-O-甲基转移酶b（comtb）、前脑啡肽（penk）和苯乙醇胺N-甲基转移酶（pnmt）的mRNA相对表达量，以actb和18S rRNA为内参基因。
- 6.
统计分析：采用线性混合效应模型分析数据，以养殖池为随机效应。水质和生长性状进行多重比较校正；血清生化、肝脏抗氧化和基因表达数据进行正态性和方差齐性检验后，分析处理、采样时间及其交互作用，并进行事后检验。显著性水平设为p<0.05。
研究结果
3.1 鱼腥草生长与尼罗罗非鱼生长性能
鱼腥草在实验期间经历了移栽适应、新芽萌发和快速生长阶段，植株保持良好生长，无异常死亡。单株鲜重从实验初期的1.75±0.04 g增至实验结束时的20.37±0.23 g。实验组罗非鱼终末体重（264.36±7.49 g）、增重率（490.09±16.71%）和特定生长率（2.957±0.047%·d-1）均略高于对照组，但差异未达统计学显著水平（p>0.05）。
3.2 解耦合鱼菜共生系统对养殖池水质的影响
3.2.1 氮参数的动态变化：实验组氨氮浓度在第15、20和60天显著低于对照组（p<0.05）。亚硝酸盐氮整体维持在低水平，实验组在第15、20、50、55和60天显著低于对照组（p<0.05）。硝酸盐氮浓度实验组高于对照组，在第15、20、25和60天差异显著（p<0.05）。总氮仅在实验第20和30天实验组显著低于对照组（p<0.05）。
3.2.2 营养物和污染物参数的动态变化：实验组总磷在第20、45、50和60天显著低于对照组（p<0.05）。高锰酸盐指数在第20、25、40和45天实验组显著低于对照组（p<0.05）。硫化物仅在第25和30天实验组显著低于对照组（p<0.05）。悬浮物差异最为显著，从第10天至实验结束，实验组在所有11个监测时间点均显著低于对照组（p<0.05）。
3.2.3 理化参数的动态变化：两组溶氧、pH和水温变化趋势基本一致，各时间点均无显著差异（p>0.05），均处于罗非鱼适宜范围。
3.3 解耦合鱼菜共生系统对罗非鱼血清生化指标的影响
3.3.1 肝功能相关指标的动态变化：实验组ALT和AST活性在第40和60天均显著低于对照组（p<0.05）。实验组AKP活性在第60天显著高于对照组（p<0.05）。
3.3.2 糖脂代谢相关指标的动态变化：GLU水平未受处理显著影响（p>0.05）。实验组TG和TC水平在第40和60天均显著低于对照组（p<0.05）。
3.3.3 蛋白质代谢和肾功能相关指标的动态变化：实验组CREA水平在所有时间点均显著低于对照组（p<0.05）。TP、ALB和GLB水平未受处理显著影响（p>0.05）。
3.4 解耦合鱼菜共生系统对罗非鱼肝脏抗氧化能力的影响
实验组CAT活性在所有采样时间点均显著高于对照组（p<0.05）。T-AOC未受处理显著影响（p>0.05）。实验组SOD活性在第40和60天显著高于对照组（p<0.05）。实验组GSH-Px活性在第40和60天显著高于对照组（p<0.05）。
3.5 解耦合鱼菜共生系统对罗非鱼脑应激相关基因表达的影响
实验组gad2表达在所有时间点均显著高于对照组（p<0.05）。comtb表达在第20和40天实验组显著低于对照组（p<0.05），第60天无显著差异（p>0.05）。pnmt表达在所有时间点实验组均显著低于对照组（p<0.05）。penk表达在所有时间点实验组均显著高于对照组（p<0.05）。
讨论总结与研究结论
讨论部分指出，基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统对养殖水环境产生了显著的阶段性调控效果。系统主要通过降低氨氮和亚硝酸盐氮等潜在风险因子、提升硝酸盐氮比例、减少总磷和高锰酸盐指数，并持续有效地降低悬浮物浓度，从而在一定程度上改善了养殖水的营养组成和污染物负荷，为罗非鱼提供了相对稳定的生存环境。尽管水质改善并未转化为显著的生长增益，这可能是因为两组水质均处于罗非鱼的耐受范围内，未发生从有害到安全的质性转变，但系统在维持罗非鱼正常生长的同时，成功实现了鱼腥草的生物量积累，体现了资源的协同利用。
在生理层面，该系统表现出多方面益处。血清生化分析显示，系统有助于改善罗非鱼的肝功能（降低ALT、AST）和脂质代谢状态（降低TG、TC），并通过降低肌酐水平提示对肾功能有积极影响，同时增强了非特异性免疫功能（提高AKP）。肝脏抗氧化指标表明，系统显著提升了过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，增强了肝脏的酶促抗氧化防御能力。脑部基因表达分析揭示了系统对神经应激状态的调节作用：编码抑制性神经递质合成酶和前脑啡肽的基因（gad2、penk）持续上调，而参与儿茶酚胺合成与代谢的关键酶基因（pnmt、comtb）则下调或阶段性下调。这暗示系统可能通过增强神经抑制和应激缓冲机制，同时降低交感神经兴奋性，共同维持脑部神经化学稳态，减轻环境应激。研究人员认为，这种综合效应可能源于水质改善与鱼腥草根系分泌物或微生态变化的共同作用。
研究结论为：结果表明，该系统对养殖水环境具有一定的调控作用，主要体现在氨氮、亚硝酸盐氮和总氮的降低；硝酸盐氮的阶段性升高；以及总磷、高锰酸盐指数和悬浮物的降低。其中对悬浮物的调控作用较为持久，表明养殖水体的营养成分和污染物负荷得到了一定程度的改善。在尼罗罗非鱼的生理状态方面，该系统有助于改善肝功能和脂质代谢状态，增强抗氧化防御能力，表现为血清ALT、AST、TG、TC和CREA水平降低，AKP活性升高，以及肝脏CAT、SOD和GSH-Px活性升高。同时，gad2和penk持续上调，pnmt持续下调，comtb呈阶段性下调，表明该系统可能调节尼罗罗非鱼的神经和应激相关调节过程。总体而言，基于鱼腥草的解耦合鱼菜共生系统可协调调控养殖水环境并影响尼罗罗非鱼的生理状态；通过将植物生产单元与养殖单元分离，同时通过循环水保持功能耦合，便于收获和单元维护，为植物生产与水产养殖的协同管理提供了一种新的系统组织形式。
