兼具湿粘附与抗菌功能的邻苯二酚改性壳聚糖/银掺杂生物玻璃热敏水凝胶用于骨组织工程

《Gels》：Catechol-Modified Chitosan Thermosensitive Hydrogels Incorporating Silver-Doped Bioglass Nanoparticles for Bone Regeneration

　　

壳聚糖（Chitosan, Chit）基热敏水凝胶（thermosensitive hydrogels）因具备生物相容性（biocompatibility）、生物可降解性（biodegradability）以及在生理温度下发生溶胶-凝胶转变（sol–gel transition）的能力，成为组织工程（tissue engineering）领域极具前景的生物材料。在本研究中，研究人员开发了基于邻苯二酚改性壳聚糖（catechol-modified chitosan, Chit-Cat）的水凝胶，以改善湿态条件下的组织粘附（tissue adhesion）性能，并复合银掺杂生物玻璃纳米颗粒（silver-doped bioglass nanoparticles, Ag-BGNPs）以增强抗菌活性。水凝胶通过静电相互作用（electrostatic interactions）形成，以β-甘油磷酸钠（β-glycerophosphate, β-GP）作为交联剂。所得水凝胶表现出适用于注射（injectability）的剪切变稀行为（shear-thinning behaviour），并对L929成纤维细胞（fibroblasts, ~84%）和人成骨细胞（osteoblasts, ~92%）表现出细胞相容性（cytocompatibility）。总体而言，所开发的热敏水凝胶结合了生理温度凝胶化（physiological-temperature gelation）、增强的粘附性、抗菌活性和细胞相容性，凸显其作为多功能可注射生物材料用于组织工程和骨再生（bone regeneration）的潜力。

骨组织工程（BTE，利用生物材料促进骨再生的学科）旨在开发可替代传统骨移植（如自体骨、同种异体骨）的创新方案，以克服供区损伤、感染风险及来源有限等问题。壳聚糖（Chit，一种天然阳离子多糖）水凝胶因具备生物相容性、可降解性及对细胞外基质（ECM，细胞外的大分子网络）的一定模拟能力，被视为骨组织工程的理想候选材料。然而，壳聚糖水凝胶在生理条件下粘附性有限，且难以稳定附着于周围组织。受贻贝粘附蛋白中L-DOPA残基启发，邻苯二酚（Catechol，模拟贻贝湿粘附的官能团）改性可显著增强水凝胶的界面粘附。另一方面，生物玻璃纳米颗粒（BGNPs，可刺激骨形成的纳米材料）在降解过程中可释放Si⁴⁺、Ca²⁺等离子以刺激骨形成，而Ag⁺则能通过破坏细菌电子传递、DNA复制及细胞膜发挥抗菌作用。因此，将邻苯二酚改性壳聚糖与银掺杂生物玻璃纳米颗粒（Ag-BGNPs，掺入银离子的抗菌纳米材料）相结合，构建兼具湿粘附、抗菌和可注射特性的多功能水凝胶，对于推进骨再生修复具有重要研究意义。

基于上述背景，研究人员开发了基于邻苯二酚改性壳聚糖（Chit-Cat）的热敏可注射水凝胶体系，以β-甘油磷酸钠（β-GP，一种带负电的盐类交联剂）作为静电交联剂，并进一步将Ag-BGNPs均匀掺入上述聚合物网络。研究团队系统评价了该复合水凝胶的理化性质、力学行为、湿态粘附性能、抗菌活性及体外细胞相容性，以评估其在骨组织工程中的潜在应用价值。

为开展研究，研究人员首先采用碳二亚胺化学法将邻苯二酚基团接枝到壳聚糖骨架上，通过¹H NMR（质子核磁共振）和UV-vis（紫外-可见吸收光谱）验证化学结构并计算取代度（DS，接枝比例的量化指标）。Ag-BGNPs采用溶胶-凝胶法（Sol–gel，湿化学合成法）在惰性气氛中合成，并经扫描透射电子显微镜（S-TEM，形貌表征技术）和能量色散X射线光谱（EDS，元素分析技术）确认形貌与元素组成。抗菌实验选用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，耐药革兰氏阳性菌）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa，革兰氏阴性致病菌），通过菌落计数（CFU，单位体积活菌数）、光密度（OD，溶液吸光度）及Log reduction评估液体环境下的杀菌能力；同时利用结晶紫（CV，生物膜染料）染色和2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC，检测代谢活性的试剂）代谢活性测定评价抗生物膜性能。粘附性能通过离体大鼠股骨宏观粘附观察及猪皮肤搭接剪切（Lap-shear，粘附强度测试方法）实验进行量化，流变学特性通过旋转流变仪测定。体外生物相容性以小鼠成纤维细胞（L929 fibroblasts，小鼠结缔组织细胞系）和来源于一名66岁白人女性的人原代成骨细胞（hOBs，直接从人骨分离的细胞）为模型，采用Alamar-blue代谢活性检测、活/死细胞（Live/Dead）荧光染色及鬼笔环肽/核染（Phalloidin/DAPI）细胞骨架分析进行评价。水凝胶通过壳聚糖溶液与56% β-GP在37 °C下静电交联形成，SEM用于观察内部孔隙结构。

2.1. Chit-Cat共轭物的合成与表征：研究人员通过¹H NMR在δ = 6.7–6.9 ppm处观察到芳环质子特征峰，证实邻苯二酚成功接枝。UV-vis在约280 nm处的吸收峰进一步支持该结论，且300 nm以上无吸收，表明接枝的邻苯二酚以还原态形式存在。两种方法测得的取代度（DS）分别约为2.3%和2.6%，结果相互印证。

2.2. Ag-BGNPs的合成与表征：S-TEM图像显示所得颗粒主要为球形，分散均匀，无明显团聚，平均粒径为117.2 ± 17.4 nm。EDS能谱分析确认了Ag⁺在生物玻璃基质中的成功掺入。

2.3. Ag-BGNPs的抗菌试验：在液体培养基中，10% Ag-BGNPs处理可显著降低MRSA和P. aeruginosa的菌落数，OD_{610 nm}值下降，Log reduction值显著为正，证实材料具有体外抗菌活性。在抗生物膜实验中，10% Ag-BGNPs可剂量依赖性地降低两种细菌的生物膜生物量（CV法）和代谢活性（TTC法），其中对P. aeruginosa的抑制效果更为显著。

2.4. Chit-Cat水凝胶的制备：研究人员通过Chit-Cat正电荷氨基与β-GP负电荷磷酸基团间的静电相互作用，在37 °C生理温度下诱导形成三维水凝胶网络。SEM显示凝胶断面呈现高度多孔且非均质的微观结构。负载10% Ag-BGNPs后，材料宏观上呈轻微粉色泽，并保持可注射所需的流动特性。

2.5. 粘附力学测试：离体大鼠股骨实验表明，改性水凝胶可在重力条件下稳定粘附于骨表面。定量lap-shear测试显示，Chit-Cat 6（低β-GP用量）的粘附强度达9.62 ± 2.39 kPa，显著优于未改性对照（Chit 6，1.39 ± 0.85 kPa）及Chit-Cat 10（2.15 ± 0.06 kPa），接近临床用纤维蛋白胶（13.5 kPa）和聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）水凝胶（13–15 kPa）的水平，表明适度交联更有利于邻苯二酚在界面处的充分暴露与相互作用。

2.6. 流变学表征：频率扫描显示，所有水凝胶在整个测试频率范围内存储模量（Storage Modulus, G′，表征材料弹性响应能力）均高于损耗模量（Loss Modulus, G″，表征材料粘性耗散能力），呈典型粘弹性网络行为。水凝胶表现出剪切稀化（Shear-thinning，粘度随剪切速率增加而降低）特性，有利于通过微创注射方式植入。10% Ag-BGNPs的掺入未显著改变整体粘弹行为。

2.7. 体外细胞实验：在L929成纤维细胞模型中，Chit-Cat 6在第1、3天的代谢活性（约为对照组的50–60%）优于Chit-Cat 10（约10%和3%），但培养14天后两组趋于一致（约80–85%）。活/死染色显示死细胞极少，细胞随时间推移在凝胶表面逐渐铺展。在hOBs实验中，所有配方均保持细胞相容性。Chit-Cat 6 + 10% Ag-BGNPs组表现出最多的活细胞数和最佳的细胞铺展形态，至第14天最接近组织培养聚苯乙烯（Tissue Culture Polystyrene, TCPs）对照组，研究人员将此归因于生物玻璃纳米颗粒释放的活性离子刺激成骨细胞活性。

讨论与结论部分指出，该研究表明Chit-Cat水凝胶的湿粘附性能受配方中β-GP含量的调控，较低的交联密度有助于维持邻苯二酚的界面可及性，从而获得更强的湿态粘附；高取代度并不必然对应高粘附强度，网络结构的整体设计更为关键。流变学结果证实材料具备良好的可注射性和结构稳定性。生物学评价证实，邻苯二酚功能化改善了细胞附着，而Ag-BGNPs的引入在提供抗菌功能的同时未损害细胞相容性，其释放的活性离子可能进一步增强成骨细胞的定植能力。综上所述，研究人员成功构建并系统表征了Chit-Cat/β-GP热敏水凝胶复合Ag-BGNPs的多功能体系。该材料将生理温度凝胶化、湿粘附增强、抗菌与抗生物膜活性以及细胞相容性整合于单一平台，展现出作为可注射骨再生生物材料的显著潜力，尤其适用于需在缺损部位长期稳定保留并局部控制细菌感染的场景。