Fisetin作为新型DYRK1B抑制剂在卵巢癌中诱导凋亡与铁死亡效应的鉴定及生物学评价

《Drug Design, Development and Therapy》：Identification and Biological Evaluation of Fisetin as a Novel DYRK1B Inhibitor in Ovarian Cancer with Apoptotic and Ferroptotic Effects

DYRK1B激酶已成为肿瘤存活、静止（quiescence）与化疗耐药的重要调控因子，是一种具有吸引力的治疗靶点。天然化合物因其抗癌特性而备受关注，并被广泛研究用于调节癌症相关信号通路。本研究旨在筛选并鉴定可作为DYRK1B抑制剂的天然化合物，并评估其作为卵巢癌治疗候选药物的潜力。研究人员利用虚拟筛选（virtual screening）、计算机辅助分子对接（in-silico molecular docking）及体外激酶实验（in-vitro kinase assay），鉴定出非瑟酮（Fisetin）作为一种潜在的DYRK1B抑制剂，其半抑制浓度（IC₅₀）为1.2 μM。随后在卵巢癌细胞系中进行的体外分析显示，DYRK1B下游靶点磷酸化水平降低，表现为p27在Ser¹⁰位点的磷酸化减少，同时细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达增加，表明静止细胞在DYRK1B被有效抑制后重新进入细胞周期。该抑制作用进一步通过γ-H2AX积累诱导DNA损伤与细胞凋亡，随后伴随半胱天冬酶-3（caspase 3）及多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的切割。为深入探究Fisetin的机制性作用，研究人员进行了RNA测序（RNA-seq），结果显示铁死亡（ferroptosis）通路富集。通过实时荧光定量PCR（qPCR）与蛋白质印迹分析（Western blot）对铁死亡相关RNA-seq数据进行验证，证实转铁蛋白受体（TFRC）表达上调，而铁输出蛋白SLC40A1表达下调，导致铁离子累积。此外，作为抑制铁死亡的关键蛋白——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通过抑制脂质过氧化发挥保护作用，该蛋白表达亦被发现降低。采用C11-BODIPY进行的脂质过氧化检测表明脂质活性氧（lipid ROS）水平升高，且该效应可被铁死亡抑制剂ferrostatin-1有效逆转。综上所述，研究人员的结果揭示Fisetin是一种有效的DYRK1B抑制剂，可通过诱导细胞凋亡进一步导致卵巢癌细胞死亡，同时调节铁死亡相关通路，凸显了Fisetin在卵巢癌治疗中的潜在应用价值。

卵巢癌（ovarian cancer, OC）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，因早期症状隐匿而常被称为“沉默杀手”。据Global Cancer Observatory（GLOBOCAN）2020预测，到2040年卵巢癌发病率将上升42%，达到445,721例新发病例，是预后最差的妇科恶性肿瘤。晚期患者的标准治疗为肿瘤细胞减灭术联合铂类和紫杉醇类化疗，但超过80%的患者在初始治疗后出现复发，临床上迫切需要鉴定能够选择性抑制卵巢癌关键分子驱动因子且副作用小的新型靶向疗法。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1B（dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1B, DYRK1B）是DYRK激酶家族成员，通过磷酸化多种细胞周期蛋白在细胞周期调控、增殖、分化、静止（quiescence）及细胞凋亡中发挥关键调控作用。DYRK1B在G0期细胞中高表达，通过促进细胞周期蛋白D（cyclin D）异构体的分解和稳定细胞周期依赖性激酶抑制剂p27^Kip1（CDKN1B）来维持细胞静止状态。研究表明，DYRK1B在肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌和宫颈癌等多种肿瘤中过表达，而在正常组织中除骨骼肌外表达较低。此外，多项研究证实DYRK1B抑制剂对多种肿瘤具有疗效，且与常规抗癌药物联用可产生协同效应，对人类正常成纤维细胞或卵巢上皮细胞影响甚微，表明DYRK1B是卵巢癌治疗的有前景的靶点。天然化合物因其副作用有限、毒性较低而在药物研发中受到越来越多的关注。黄酮类化合物因具有多效性抗癌特性，包括抑制癌细胞活力、增殖、转移、血管生成及侵袭能力并诱导细胞凋亡，而备受瞩目。流行病学研究进一步提示膳食黄酮醇（如山奈酚、槲皮素、杨梅素）和黄酮（如木犀草素）的摄入与卵巢癌风险降低约20-40%相关。值得注意的是，多种黄酮类化合物已被研究作为DYRK1A抑制剂，然而相较于DYRK1A，黄酮类化合物靶向DYRK1B的潜力受到的关注有限。尽管β-咔啉类生物碱harmine已被证实在肝星状细胞中抑制DYRK1B活性，但有关卵巢癌中DYRK1B抑制的研究证据仍然有限，这凸显了进一步探索天然化合物（特别是黄酮类）作为潜在DYRK1B调节剂及其在卵巢癌治疗中相关性的必要性。

本研究采用整合策略，首先通过生物信息学分析（包括GEPIA2、UALCAN和cBioPortal数据库）评估DYRK1B在卵巢癌中的临床相关性与遗传改变，并结合50例卵巢癌组织微阵列（来自TissueArray.com）的免疫组织化学（immunohistochemistry）进行蛋白水平验证；随后利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲低DYRK1B以确认其治疗靶点地位。研究基于美国国家癌症研究所（National Cancer Institute, NCI）天然产物库进行虚拟筛选（virtual screening），通过分子对接（molecular docking）分析化合物与DYRK1B蛋白（PDB ID: 8C2Z）的结合模式，并采用体外激酶实验（in-vitro kinase assay）测定抑制活性。药代动力学与类药性通过SwissADME预测。研究使用OVCAR-3、A2780、SKOV3等卵巢癌细胞系及WI-38正常成纤维细胞，通过CCK-8法、克隆形成实验、蛋白质印迹分析（Western blot）、流式细胞术（flow cytometry）、RNA测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（qPCR）及C11-BODIPY脂质过氧化检测等功能实验系统评估非瑟酮（Fisetin）的活性与机制。

Bioinformatic Analysis Reveals Elevated DYRK1B Expression in OC
研究人员通过GEPIA2数据库分析发现，DYRK1B在卵巢癌组织中的表达显著高于正常卵巢组织；UALCAN数据库的Kaplan-Meier生存分析显示，DYRK1B高表达患者的总生存期显著缩短。cBioPortal分析表明，在卵巢浆液性囊腺癌中DYRK1B的扩增率为6.55%。免疫组织化学结果显示，正常卵巢组织中DYRK1B染色极少，而高级别浆液性卵巢癌中呈强阳性的胞质和细胞膜染色。蛋白质印迹分析进一步证实，与WI-38正常成纤维细胞相比，多种卵巢癌细胞系中DYRK1B表达升高，其中OVCAR-3细胞表达最为显著。这些结果共同证实DYRK1B在卵巢癌中过表达并与不良预后相关，凸显其作为治疗靶点的潜力。

Validation of DYRK1B as a Therapeutic Target in OC
研究人员利用siRNA在卵巢癌细胞系中敲低DYRK1B，蛋白质印迹分析显示两种siRNA均能有效降低DYRK1B表达，其中siRNA-I敲低效率更高并被选为后续实验使用。在OVCAR-3和A2780细胞中，DYRK1B敲低导致cyclin D1表达增加约2.2倍，同时p27在Ser¹⁰位点的磷酸化水平显著降低，表明静止的卵巢癌细胞被诱导重新进入细胞周期。此外，敲低72小时后，两种细胞系中均出现γ-H2AX累积以及半胱天冬酶3（caspase 3）切割，提示DNA损伤和凋亡信号通路的激活。这些发现共同证明DYRK1B在维持卵巢癌细胞静止和存活中的关键作用，支持将其作为卵巢癌治疗靶点。

Identification of DYRK1B Inhibitor Through Virtual Screening
研究人员通过虚拟筛选从内部化合物库中鉴定出Fisetin和myricetin作为潜在的DYRK1B抑制剂。体外激酶实验显示，Fisetin对DYRK1B表现出强效抑制作用，IC₅₀为1.2 μM，而myricetin抑制作用较弱，IC₅₀为6 μM。分子对接分析显示，Fisetin在DYRK1B的ATP结合口袋中形成稳定构象，与铰链区残基L193形成氢键，并与K140、L193、N196等残基相互作用，同时与I117、V125、L246、V258等残基形成疏水相互作用。相比之下，myricetin与K140的疏水相互作用较弱。这些结果提示Fisetin是比myricetin更强效的DYRK1B抑制剂。

In silico ADME and Drug-Likeness Assessment
通过SwissADME进行的计算机辅助药代动力学（ADME）和类药性评估显示，Fisetin在亲脂性、分子大小、极性、不溶性和柔性等性质方面均处于最优范围内，尽管不饱和程度略超最优范围，但其符合Lipinski's Rule of Five和Veber's rule的全部要求，并预测具有高胃肠道吸收。而myricetin因极性过高和不饱和度过高，同时违反Lipinski's rule和Veber's rule，且预测胃肠道吸收较低。总体而言，Fisetin表现出优于myricetin的预测类药性和药代动力学性质。

Pharmacological Inhibition of DYRK1B by Fisetin Induces Cell Cycle Re-Entry
药理学抑制实验表明，Fisetin以剂量依赖方式抑制DYRK1B活性，伴随p27在Ser¹⁰位点磷酸化降低和cyclin D1表达增加，该效应与已知的DYRK1B抑制剂INDY相似。增殖标志物Ki-67的表达呈双相性：低剂量时升高，而60 μM高剂量时显著降低，提示低剂量下细胞周期再进入信号增强。流式细胞术分析显示，30 μM Fisetin处理A2780细胞24小时后，G0/G1期细胞比例显著降低而G2/M期比例增加；60 μM时该效应更为显著。这些结果共同表明Fisetin介导的DYRK1B抑制可诱导静止的卵巢癌细胞重新进入细胞周期。

Fisetin-Mediated DYRK1B Inhibition Induces DNA Damage and Apoptosis
蛋白质印迹分析显示，Fisetin以剂量依赖方式降低卵巢癌细胞中DYRK1B表达，并上调γ-H2AX，提示DNA损伤。该DNA损伤反应伴随执行型caspase 3的强效激活及PARP的切割，表明细胞凋亡通路的启动。72小时处理后，Fisetin在30和60 μM浓度下诱导的促凋亡潜力高于阳性对照INDY。亚G1期细胞比例呈剂量依赖性增加，与DNA片段化和凋亡细胞积累一致。Annexin V/7-AAD染色进一步显示Fisetin（30和60 μM）处理48和72小时后，凋亡细胞比例呈时间和剂量依赖性增加。这些结果提示Fisetin通过抑制DYRK1B诱导DNA损伤和凋亡细胞死亡。

Fisetin Decreases Cell Viability and Long-Term Proliferative Capacity
CCK-8细胞活力检测显示，Fisetin处理48小时后，A2780、OVCAR-3和SKOV3细胞活力均呈剂量依赖性降低，在30 μM及以上浓度时显著降低；100 μM时，A2780、OVCAR-3和SKOV3细胞活力分别降低42.6%、37.3%和30.8%，其中A2780最为敏感，但各细胞系IC₅₀均大于100 μM。克隆形成实验显示，Fisetin（10-60 μM）以剂量依赖方式抑制克隆形成，在高于30 μM时效果显著，A2780和OVCAR-3细胞在60 μM时几乎完全被抑制，效果优于阳性对照INDY（30 μM）。形态学分析显示Fisetin处理后A2780细胞出现不规则肿大，提示细胞应激。

Transcriptomic Profiling Reveals Fisetin-Induced Ferroptosis in OC
RNA测序分析在30 μM Fisetin处理24小时的A2780细胞中鉴定出8,196个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中4,002个上调，4,194个下调。KEGG富集分析显示铁死亡（ferroptosis）通路是最显著富集的通路之一，基因集富集分析（GSEA）进一步证实铁死亡通路呈正富集（NES = 1.2），而脂肪酸降解通路呈负富集（NES = -1.6）。转录组数据显示，作为铁死亡负向调控因子的SLC40A1（ferroportin）和GPX4表达下调，而铁正向调控因子TFRC表达上调，提示Fisetin可能通过破坏铁和脂质氧化还原代谢稳态来促进铁死亡敏感性。

Fisetin Promotes Ferroptosis-Associated Changes by Upregulating TFRC and Suppressing GPX4 Activity in OC
qPCR验证显示，60 μM Fisetin处理A2780细胞24小时后，TFRC mRNA表达上调至约2.2倍，而GPX4、SLC40A1和PLTP表达分别下调至约0.5倍、0.7倍和0.7倍。蛋白质印迹分析在SKOV3和A2780细胞中得到一致结果：Fisetin处理72小时后，TFRC蛋白表达上调而GPX4蛋白表达下调，呈现剂量依赖性。C11-BODIPY脂质过氧化检测显示，60 μM Fisetin处理导致A2780细胞脂质活性氧（lipid ROS）显著增加，而铁死亡抑制剂ferrostatin-1（5 μM）可部分逆转该效应。然而，ferrostatin-1仅部分恢复Fisetin诱导的细胞活力下降，提示铁死亡相关机制虽可能参与Fisetin诱导的细胞毒性，但细胞凋亡可能在Fisetin诱导的细胞死亡中发挥更主要作用。

研究人员在讨论中指出，DYRK1B因其在细胞周期控制和静止中的独特调控功能而日益受到关注，其作为癌基因和肿瘤细胞存活因子发挥作用。以往研究表明天然化合物harmine可抑制DYRK1B活性，但有关卵巢癌中DYRK1B选择性抑制剂的研究仍然缺乏。本研究通过基于结构的虚拟筛选方法，首次鉴定出天然化合物Fisetin是一种有前景的DYRK1B抑制剂。分子对接分析显示，Fisetin独特的结构特征（包含两个苯基环和带羟基的杂环核心）使其能够与活性位点，特别是铰链区残基L193形成氢键，从而稳定在ATP结合口袋中。此外，Fisetin相较于myricetin更强的疏水相互作用是其对DYRK1B抑制活性增强五倍的原因，这一发现支持Fisetin作为未来开发有效DYRK1B抑制剂的良好候选药物。在机制方面，本研究证明Fisetin能够抑制卵巢癌中的DYRK1B活性，其标志为p-p27（Ser¹⁰）降低和cyclin D1上调，这一效应干扰了DYRK1B介导的调控机制，可能促使癌细胞过早退出静止状态并进入细胞周期。这种对静止癌细胞的靶向治疗优势是传统疗法难以实现的。尽管已有研究使用EHT5372和RO5454948等合成抑制剂验证了该机制，但本研究将其拓展至具有潜在临床益处的天然化合物。关于细胞凋亡，尽管Fisetin在非恶性疾病中显示细胞保护效应，但在癌症模型中已知可诱导凋亡。本研究揭示Fisetin通过激活依赖于DYRK1B的凋亡信号通路促进DNA损伤和促凋亡反应。由于DYRK1B通过修复双链断裂维持核糖体DNA稳定性，其抑制会破坏这种保护功能，导致DNA损伤积累，进而通过上调cleaved caspase 3和PARP触发凋亡。这支持了Fisetin诱导的卵巢癌凋亡是由DYRK1B依赖性凋亡信号通路激活所驱动的观点。在铁死亡方面，尽管Fisetin在非恶性疾病模型（如心肌病、慢性肾病、多发性硬化）中通过下调TFRC和恢复GPX4水平来抑制铁死亡，但本研究通过RNA-seq分析发现Fisetin在卵巢癌中反而激活了铁死亡相关通路。TFRC上调和GPX4下调共同导致脂质过氧化物修复受损，增强铁死亡敏感性。然而，这些分子变化及ferrostatin-1的部分rescue效应并未确立铁死亡为Fisetin诱导细胞死亡的主要方式，而是提示Fisetin可能调节铁死亡相关过程并增强卵巢癌细胞对铁死亡的敏感性，同时细胞凋亡可能是更为突出的机制。由于凋亡抵抗的癌细胞可能仍对铁死亡应激保持敏感，这一发现提示激活铁死亡可为克服凋亡抵抗提供替代或补充策略。此外，研究也指出铁死亡在癌症中的作用具有情境依赖性，过度的或非预期的铁死亡可能通过损害CD8⁺T细胞和自然杀伤细胞的抗肿瘤免疫而促进肿瘤进展。研究人员同时承认若干局限性：首先，激酶实验样本量较小（n = 3），尽管作为二次筛选步骤已足够验证化合物活性，但未来研究需更大样本量和更多生物学重复加以确认。其次，本研究为初步研究，全部实验均在体外条件下完成，可能无法完全反映人类生理和肿瘤微环境的复杂性，因此亟需临床评估以确定其治疗潜力与转化意义。

本研究的结论指出，Fisetin作为治疗卵巢癌的一种有前景的治疗化合物被鉴定出来。在机制上，Fisetin抑制DYRK1B活性，导致静止细胞重新进入细胞周期，并随后诱导细胞凋亡。此外，Fisetin还调节了多个铁死亡相关分子通路，提示铁死亡相关过程可能参与其抗癌活性。然而，这些发现并未确立铁死亡为Fisetin诱导细胞死亡的主要机制。总体而言，DYRK1B抑制诱导的细胞周期重新进入和细胞凋亡是Fisetin抗癌活性的关键机制，而铁死亡相关反应可能对其总体治疗效果在卵巢癌中做出贡献。