茶黄素抑制肝细胞癌的分子机制：基于反向虚拟筛选与生物学实验验证的研究

《Biomolecules》：Exploring the Molecular Mechanism of Theaflavin in Inhibiting Hepatocellular Carcinoma Through Reverse Virtual Screening and Biological Experimental Validation

　　

肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的主要原因之一，凸显了对疗效更好、毒性更低的治疗药物的迫切需求。茶黄素（TF）是红茶中含量丰富的多酚类物质，具有广谱抗肿瘤活性。然而，TF在HCC中的直接靶点和分子机制尚未完全阐明。本研究采用反向虚拟筛选预测TF的候选靶点，并通过分子对接、分子动力学（MD）模拟、药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）、热位移分析（TSA）和内源荧光光谱进行验证。荧光滴定结果显示，TF可直接结合CDK2、JNK1和JNK2，结合自由能分别为-37.08、-38.77和-37.27 kJ/mol，结合常数Ka分别为3.16×106、6.25×106和3.42×106 L·mol-1。TF以剂量依赖方式抑制HepG2、SK-Hep-1和Huh-7细胞的活力，增强活性氧（ROS）积累，降低线粒体膜电位，提高Bax/Bcl-2比值并激活caspase-9/3，从而通过线粒体途径诱导凋亡。此外，TF诱导G0/G1期阻滞并抑制细胞迁移和侵袭，尽管后一效应可能部分归因于细胞活力降低。在裸鼠皮下异种移植模型中，TF显著抑制肿瘤生长并促进凋亡。综上所述，TF是一种可能与CDK2和JNK1/2相互作用的多靶点化合物，与细胞周期和MAPK相关信号通路的改变有关，可作为HCC治疗的潜在先导化合物。

研究背景与目的

肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要病理类型，约占所有肝癌病例的85%-90%。根据《柳叶刀》2025年报告，肝癌在全球恶性肿瘤发病率中排名第六，在癌症相关死亡率中排名第三。若缺乏有效干预，全球新发肝癌病例将从2022年的87万上升至2050年的152万，届时每年约137万人将死于肝癌。尽管免疫检查点抑制剂联合疗法已将晚期HCC的中位总生存期延长至两年以上，但HCC的5年生存率仍仅为5%-30%，约50%-60%的患者在确诊时已处于晚期，治疗选择极为有限。因此，从天然产物中发现新型高效低毒的HCC先导化合物具有重要的临床意义。

茶黄素（TF）是红茶发酵过程中儿茶素氧化缩合产生的一类主要多酚化合物，其衍生物包括TF、TF2a、TF2b和TF3。已有研究表明TF具有抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗肿瘤等多种生物活性。在抗肿瘤方面，TF可通过调节生长转录因子、细胞迁移相关蛋白、细胞周期调控蛋白和凋亡相关蛋白来抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。然而，TF在HCC中的具体靶点尚未被系统鉴定。因此，系统识别TF在HCC中的直接作用靶点并阐明其分子机制，对推动其临床转化具有重要意义。

研究人员采用反向虚拟筛选策略预测TF在HCC中的潜在结合靶点，随后通过GO和KEGG富集分析，并结合网络药理学分析、计算模拟（分子对接、分子动力学模拟和结合自由能计算）、DARTS、TSA和内源荧光光谱等实验方法，系统验证了TF与CDK2、JNK1和JNK2的直接结合，获得了与CDK2、JNK1和JNK2的结合常数（K_a）。通过体外细胞实验，利用CCK-8、集落形成、Annexin V-FITC/PI染色、PI细胞周期分析、划痕愈合和Transwell实验，评估了TF对HepG2、SK-Hep-1和Huh-7细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭的影响。在体内裸鼠皮下异种移植瘤模型中，测量了肿瘤体积和重量，并通过TUNEL染色评估了肿瘤组织中的凋亡情况。此外，为探讨细胞周期和MAPK信号通路在TF抗HCC作用中的潜在参与，检测了TF处理后细胞中cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6和JNK1/2的蛋白水平。该研究旨在为开发TF作为抗HCC候选药物提供实验依据，并为天然产物多靶点抗肿瘤机制研究提供新见解。

关键技术方法

研究人员使用AutoDock Vina v1.2.6进行反向虚拟筛选，以TF为配体，针对包含299个抗肿瘤靶点蛋白的内部数据库进行对接。采用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，并使用Cytoscape v3.10.4构建靶点-通路网络。利用GROMACS v2022进行50 ns分子动力学（MD）模拟，采用MM/GBSA方法计算结合自由能。通过原核表达纯化CDK2、JNK1和JNK2重组蛋白，使用Techcomp FL970荧光分光光度计进行内源荧光光谱滴定实验。采用药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验和热位移分析（TSA）验证TF与靶蛋白的直接结合。动物实验使用5-6周龄雄性BALB/c-nude小鼠（河南斯克贝斯生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(豫)2025-0005），建立HepG2细胞皮下异种移植模型。

研究结果

3.1 反向虚拟筛选预测TF的潜在结合靶点

通过基于抗肿瘤靶点数据库的反向虚拟筛选，选取评分最高的前60个蛋白作为候选靶点。TF与多种肿瘤相关蛋白表现出强结合潜力，对接分数主要分布在-12.4至-10.6 kcal/mol范围内。

3.2 GO、KEGG富集分析与网络药理学分析

GO富集分析显示候选靶点主要富集于蛋白磷酸化、细胞周期调控、凋亡、细胞迁移、应激反应和炎症反应等生物过程。KEGG富集分析表明候选靶点主要涉及MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT、凋亡、细胞周期和癌症相关通路。靶点-通路网络分析揭示MEK1、CDK6、CDK2、AKT1、IKBKB、PRKCB、RPS6KB、PKACA和JNK1可能在网络中占据中心位置。

3.3 TF时间依赖性和剂量依赖性抑制肝癌细胞活力

正常肝细胞L02和THLE-2对TF具有较高耐受性，24小时IC₅₀分别为173.82 μM和163.96 μM。TF对肝癌细胞HepG2、SK-Hep-1和Huh-7显示出显著的剂量依赖性和时间依赖性增殖抑制作用，24小时IC₅₀分别为79.89、24.38和34.35 μM。

3.4 TF诱导肝癌细胞凋亡

Hoechst 33342/PI双染和Annexin V-FITC/PI流式细胞术证实TF以剂量依赖方式诱导三种肝癌细胞凋亡。DCFH-DA探针检测显示TF处理显著增加细胞内ROS水平。JC-1染色表明TF导致线粒体膜电位下降。Western blot结果显示TF上调Bax表达、下调Bcl-2表达，显著提高Bax/Bcl-2比值。caspase活性检测表明TF以时间依赖方式激活caspase-9和caspase-3。

3.5 TF阻滞肝癌细胞于G₀/G₁期

PI染色结合流式细胞术分析显示，随着TF浓度增加，HepG2、SK-Hep-1和Huh-7细胞中G₀/G₁期细胞比例逐渐升高，同时S期和G₂/M期细胞比例呈剂量依赖性降低。Western blot检测表明TF处理后CDK2、CDK4、CDK6和cyclin D1的表达水平均呈剂量依赖性下降。

3.6 TF抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移

集落形成实验显示TF以剂量依赖方式减少肝癌细胞的集落数量。Transwell侵袭实验表明TF处理后穿过基底膜的细胞数呈剂量依赖性减少。划痕愈合实验进一步证实TF处理显著减缓划痕闭合速率。Western blot结果显示TF处理后HepG2细胞中FAK、vimentin、MMP2和MMP9的蛋白表达水平呈剂量依赖性下调。

3.7 TF抑制裸鼠皮下肝癌异种移植瘤生长

在HepG2细胞裸鼠皮下成瘤模型中，TF处理组的肿瘤体积显著小于对照组，并呈剂量依赖性减小。肿瘤重量分析进一步证实TF可剂量依赖性地减轻肿瘤负荷。HE染色显示TF处理组出现不同程度的肿瘤组织坏死、细胞密度降低和结构紊乱。TUNEL染色显示TF处理组肿瘤组织中TUNEL阳性凋亡细胞数量呈剂量依赖性显著增加。

3.8 通过DARTS和TSA验证TF的靶点

DARTS实验显示，与DMSO对照组相比，TF处理组中CDK2和JNK蛋白的降解水平显著降低，而PKACA、AKT、CDK6、PRKCB、MEK1、IKBKB和RPS6KB蛋白的降解水平无显著变化。TSA实验表明，对于CDK2、JNK1和JNK2，尤其在65-75°C高温范围内，TF处理组残余蛋白水平较对照组显著增加。

3.9 通过计算模拟和内源荧光光谱验证TF与CDK2、JNK1和JNK2的结合

分子对接结果显示TF与CDK2、JNK1和JNK2的活性口袋具有良好的结合预测，对接分数分别为-11.4、-11.3和-10.5 kcal/mol。MD模拟50 ns期间，CDK2-TF、JNK1-TF和JNK2-TF复合物的RMSD曲线保持相对稳定，回旋半径（Rg）波动较小。MM/GBSA结合自由能计算估计CDK2-TF、JNK1-TF和JNK2-TF的ΔG_total分别为-34.04、-25.05和-29.48 kJ/mol。内源荧光光谱滴定实验显示TF能以浓度依赖方式淬灭CDK2、JNK1和JNK2的内源荧光，结合常数K_a分别为3.16×10⁶、6.25×10⁶和3.42×10⁶ L·mol^-1，结合自由能ΔG分别为-37.08、-38.77和-37.27 kJ/mol。

讨论部分总结

TF作为一种红茶发酵过程中产生的主要多酚，已被证明具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用。本研究通过整合反向虚拟筛选、网络药理学、细胞功能实验和体内异种移植瘤模型，系统揭示了TF通过多靶点抑制HCC的分子机制。研究首次明确了TF与CDK2及JNK1/2的直接结合，为后续机制研究提供了清晰方向。TF通过线粒体凋亡途径诱导HCC细胞凋亡，这一发现与口腔癌和皮肤癌细胞的研究一致。细胞周期阻滞是TF抑制HCC细胞增殖的另一重要机制，研究发现TF使三种HCC细胞阻滞于G₀/G₁期，伴随cyclin D1、CDK2、CDK4和CDK6表达下调。TF对HCC细胞迁移和侵袭的抑制作用与上皮间充质转化标志物和基质金属蛋白酶的下调密切相关。体内实验结果进一步验证了TF的抗HCC活性。从机制整合角度看，TF可直接结合CDK2、JNK1和JNK2，TF处理伴随着对细胞周期和MAPK信号通路的多靶点效应。研究也存在若干局限性：反向虚拟筛选、分子对接和MD模拟均为计算预测，不能替代实验数据；TF与CDK2/JNK的结合亲和力和抑制效力仍需通过酶动力学、表面等离子体共振和等温滴定量热法进一步确认；TF是否直接抑制CDK2/JNK及其是否为抗HCC作用的唯一机制，仍需通过基因敲除或点突变实验确定。

结论部分翻译

本研究通过反向虚拟筛选、网络药理学分析以及体内外实验，首次证实TF可直接结合CDK2和JNK1/2，并且TF处理伴随着cyclin D1-CDK4/6-CDK2轴的下调和肝癌细胞的G₀/G₁期阻滞。同时，它通过线粒体途径诱导凋亡，抑制肝癌细胞增殖，并降低其迁移和侵袭能力（尽管这些抗迁移效应可能部分归因于细胞活力降低），并在裸鼠异种移植模型中显著抑制肿瘤生长。上述结果揭示了TF是一种靶向CDK2和JNK1/2的多靶点抗肝癌候选化合物，为肝癌的靶向治疗提供了新的实验基础和潜在的药物选择。