基于抗S2蛋白单克隆抗体的猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗体检测免疫层析试纸条的建立

《Biomolecules》：Establishment of Immunochromatographic Test Strips for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) Antibody Detection Based on Monoclonal Antibodies Against S2 Protein

　　

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性传染病。临床表现为仔猪严重腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，给全球养猪业造成重大经济损失。可靠的现场诊断工具用于PEDV早期检测，尤其是针对新发变异株，仍然匮乏。刺突（S）蛋白在病毒进入过程中起关键作用，其S₂亚基在不同PEDV毒株间高度保守。本研究表达并纯化了重组pColdI-S₂蛋白。经小鼠免疫、细胞融合和筛选，研究人员利用杂交瘤技术制备了两株靶向S₂蛋白不同保守表位的单克隆抗体（mAbs）。随后将重组S₂蛋白与普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）偶联，作为检测试剂。将葡萄球菌蛋白A（SPA）和抗S₂ mAb分别固定于试纸条的检测（T）线和质控（C）线。基于这些组分，初步建立了用于检测PEDV S₂蛋白特异性抗体的免疫层析试纸条。研究结果表明，该检测方法有望作为猪群PEDV感染血清学监测的可靠工具，促进快速临床诊断并有助于PED防控策略。

论文主体内容解读：

猪流行性腹泻（PED）由猪流行性腹泻病毒（PEDV，一种有囊膜的单股RNA肠道冠状病毒）引起，可感染各年龄猪，临床见水样腹泻、呕吐、脱水和死亡，仔猪死亡率高，给全球养猪业造成显著经济损失。PEDV于20世纪70年代首次鉴定，1984年正式描述；2010年前中国流行以经典低致病性GIa亚型为主，2010年后多省爆发由高致病性G2b变异株引起，且与经典GIa疫苗株抗原差异显著；2013年美国首次爆发后，PEDV迅速传播至欧洲、北美和亚洲。现有PEDV实验室检测包括病毒分离鉴定、间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量RT-PCR，但耗时、需专用仪器，不适合现场或临床即时检测；可靠、易操作的早期现场诊断工具，尤其针对新发变异株，仍然不足。侧向流免疫层析（LFIA）简便、快速、低成本，适合临床和现场检测。S蛋白介导病毒进入，S₁负责宿主受体识别，S₂驱动病毒膜融合且在PEDV不同毒株间高度保守并含保守中和表位；普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）具组成、结构和功能优势。因此，研究人员以S₂为诊断抗原、PBNPs为示踪材料，制备单克隆抗体（mAbs）并初步建立检测PEDV S₂抗体的免疫层析试纸条。

研究人员表达并纯化了重组pColdI-S₂蛋白，制备两株靶向S₂不同保守表位的mAbs（2A11和2H4），以PBNPs-S₂为检测探针，将SPA和2A11分别包被T线和C线，建立夹心免疫层析试纸条。结论是该试纸条特异性好、临床适用性良好，可作为猪群PEDV感染血清学监测和快速临床诊断工具，为PED防控提供新手段。

关键技术方法概述：研究人员采用原核表达系统表达截短S₂蛋白（pColdI/BL21，Ni-NTA纯化及梯度尿素复性）；以重组S₂免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、有限稀释和ELISA筛选稳定分泌抗S₂ mAbs的杂交瘤细胞株；构建重叠截短S₂片段并结合Western blotting定位B细胞表位；将重组S₂与PBNPs偶联制备检测探针，以SPA和2A11分别包被T/C线组装试纸条，并评价T线包被浓度、层析时间、灵敏度、特异性及40份临床血清样本（与实验室间接ELISA平行）。临床血清由南京农业大学Zhou Bin教授和江苏省农业科学院Zheng Qisheng教授提供；PBNPs和PEDV由Zhou Bin教授惠赠。

研究结果：

3.1 重组pColdI-S₂蛋白的表达与纯化：DNASTAR分析显示S₂蛋白280–510 aa区亲水性、抗原指数和表面概率较高；与40株不同基因型PEDV同源性94.5–100%，与GIIa最高，提示该区高度保守。PCR获693 bp片段，构建pColdI-S₂并经KpnI/HindIII双酶切验证；SDS-PAGE显示约25 kDa表达，主要形成包涵体，Western blotting证实抗His标签结合；8 M尿素溶解后Ni-NTA纯化，10–100 mM咪唑洗脱，6 M/4 M尿素梯度复性。结论为获得重组S₂蛋白。

3.2 S₂特异性单克隆抗体的筛选与鉴定：三次免疫后ELISA选择2号小鼠加强，融合后四轮有限稀释获2A11和2H4；均含κ轻链，2H4为IgG2a、效价1:409,600，2A11为IgM、效价1:819,200；Western blotting仅在PEDV感染Vero细胞中检出预期条带（糖基化使实际约150–250 kDa），IFA见感染细胞特异绿色荧光。结论为两株mAbs特异识别天然PEDV S₂。

3.3 S₂单克隆抗体B细胞表位的鉴定：通过系列重叠截短S₂蛋白和Western blotting，2H4识别表位定位至396LFTHEL403，2A11识别416MFEPRKPTV426；两表位为新型线性B细胞表位，位于S₂中部。结论为扩展S₂蛋白抗原表位库。

3.4 PBNPs-S₂免疫层析试纸条的开发与验证：

3.4.1 建立：S₂偶联PBNPs为检测探针，SPA和2A11分别固定T/C线；加样后T/C均显色判为阳性，仅C显色判为阴性。

3.4.2 Zeta电位：PBNPs、S₂、PBNPs-S₂分别为?30.10、?9.98、?24.57 mV，提示成功化学偶联且体系稳定。

3.4.3 水动力直径：PBNPs为136.8 nm，PBNPs-S₂为215.03 nm，提示S₂负载于颗粒表面。

3.4.4 电镜表征：PBNPs呈准球形、边缘略不规则，偶联后分散良好、无明显聚集、结构完整。

3.4.5 最佳T线包被浓度：比较SPA 0.5、1.25、2.0、2.75 mg/mL，2.0 mg/mL阳性信号最佳且无非特异，>2.0 mg/mL阴性出现非特异；C线固定1 mg/mL。

3.4.6 最佳层析时间：5 min T线开始显色，20 min层析基本完成且背景干净，之后NC膜开始干燥；推荐15–20 min判读。

3.4.7 分析灵敏度：人工阳性血清倍比稀释，低于15.6 ng/mL T线显色不清晰，检测限（LOD）为15.6 ng/mL。

3.4.8 特异性分析：仅PEDV阳性血清T/C显色，PEDV阴性及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、经典猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）阳性血清无T线信号，无交叉反应。

3.4.9 临床评价：40份临床血清与实验室间接ELISA平行，阳性符合率87.5%（21/24），阴性符合率100%（16/16）。结论为试纸条具良好临床适用性，但存在ELISA阳性而试纸条阴性样本。

讨论总结：讨论指出PEDV遗传变异导致毒力、组织嗜性和抗原性差异，交叉保护复杂，且无靶向抗病毒药物或特异疗法，需要低成本、简便、快速的临床诊断方法。S₂较S₁保守，GI与GII株氨基酸一致性达96–98%，核心功能基序少有插入缺失并受强负选择，含保守中和表位，适合作诊断抗原；研究选用280–510 aa并在BL21表达，减少融合标签干扰，包涵体经梯度复性。2A11和2H4靶向不同表位，所鉴定表位位于S₂中部，不同于既往多集中于胞质尾等区域，具高度保守性和良好抗原性、反应性；mAbs经ELISA、Western blotting和IFA验证特异，高亲和力为灵敏检测提供基础。试纸条优势包括PBNPs较胶体金稳定、耐氧化褪色、储存要求宽松、成本低，可避免胶体金批间颜色变化和信号衰减；S₂较S₁或N蛋白可广谱识别经典疫苗株和现地变异株；5–20 min肉眼判读无需专用仪器；性能为100%特异性、LOD 15.6 ng/mL（讨论部分概括为15 ng/mL）、临床敏感性87.5%。局限为未建立大规模统计截断值，仅以ELISA作平行定性参考；ELISA阳性LFIA阴性可能与EDC/NHS交联引起构象变化遮蔽2A11表位及病毒突变、血清空间位阻或高浓度钩状效应（hook effect）、ELISA与LFIA捕获机制差异（ELISA检测所有IgG亚型，LFIA依赖SPA介导Fc捕获）有关；SPA-LFIA仅识IgG，样本量小，低滴度样本可能仍需ELISA确认。未来拟采用2A11与2H4抗体鸡尾酒减少单表位漏检，并优化样本稀释液、PBNPs偶联过程（测试更低纳米颗粒浓度以降低背景、提高可读性、降低成本）、扩大临床样本并与金标准比较；本研究未与商业试剂盒直接比较，但为PBNPs示踪和S₂诊断抗原应用提供参考。

研究结论翻译：总之，本研究成功开发了一种基于PBNPs和重组S₂蛋白的快速免疫层析试纸条，用于检测抗PEDV S₂抗体。选择高度保守的S₂蛋白可确保广谱识别，而PBNPs提供稳定且可视的信号，无需专用设备。该试纸条表现出优异的特异性和良好的临床适用性。尽管缺乏大规模统计截断值仍是一大局限，但本研究为未来开发高效的PEDV抗体临床检测工具提供了新见解和有价值的参考。