METTL3介导的IGF2 m6A修饰通过稳定IGF2 mRNA激活PI3K-Akt通路促进内皮细胞糖尿病血管钙化表型

《Epigenetics》：METTL3-associated m6A modification of IGF2 promotes a diabetic vascular calcification phenotype in endothelial cells

　　

糖尿病血管钙化涉及内皮-间充质转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）与成骨分化，但其调控机制尚不明确。本研究旨在探讨RNA甲基转移酶METTL3介导的m6A修饰在促进EndMT与成骨分化中的作用。研究人员将人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAECs）暴露于高糖（high glucose，HG）及成骨培养基条件，以模拟糖尿病血管内皮功能障碍与成骨分化，检测EndMT与成骨标志物的mRNA及蛋白表达；通过功能缺失与功能获得实验并结合回复实验，明确其分子机制。HG处理可升高METTL3表达、整体m6A水平及EndMT标志物；在HG及成骨条件下，METTL3缺失可显著减轻HAECs的EndMT与钙化表型。Western blot分析证实METTL3促进PI3K-Akt通路活化，从而驱动EndMT。研究人员进一步发现METTL3与IGF2BP2可稳定IGF2 mRNA，提示其依赖m6A的机制；IGF2上调通过激活PI3K-Akt通路促进糖尿病成骨条件下的EndMT与成骨分化。对IGF2表达转录后调控的深入分析显示，METTL3通过依赖IGF2BP2的机制稳定IGF2 mRNA。METTL3介导的m6A修饰通过稳定IGF2 mRNA、激活PI3K-Akt通路并驱动内皮向成骨转化，促进HAECs的糖尿病血管钙化表型。研究数据提示内皮细胞可通过转分化过程主动参与糖尿病血管钙化，METTL3可能成为糖尿病血管钙化的潜在治疗靶点，尚需进一步验证。

研究背景：糖尿病所致高血糖被认为是动脉钙化与系统性动脉粥样硬化的主要病因之一，但糖尿病动脉钙化虽由高血糖启动，却由下游信号级联持续推动，除血糖管理外仍需直接治疗靶点，其具体分子机制尚不完全清楚。糖尿病血管钙化（vascular calcification，VC）的核心机制之一源于内皮-间充质转化（EndMT），并经成骨过程进展为VC；PI3K-Akt通路在细胞增殖、分化与存活调控中居中心地位，其功能障碍在心血管疾病与2型糖尿病中具有病理后果，高糖（HG）等因子激活该通路可促进EndMT，该通路亦在间充质细胞成骨分化中起关键作用。胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）作为生长因子参与细胞增殖与血管生成，与PI3K-Akt通路密切相关，可磷酸化Akt并增强成骨分化。m⁶A修饰是真核mRNA常见的内部修饰，作为核心写入蛋白的甲基转移酶样3（methyltransferase-like 3，METTL3）水平受血糖浓度显著影响并呈上升趋势，近期研究显示METTL3在多种病理条件下通过调控m⁶A修饰促进EndMT。因此本研究拟探讨METTL3在HG条件下对糖尿病血管内皮功能障碍与钙化过程的调控作用，提出HG上调METTL3、激活EndMT相关基因从而促进VC发展的假设，为糖尿病血管并发症防治提供理论依据。

研究人员开展的研究与结论：研究以HAECs为对象，建立METTL3稳定敲低细胞系，经HG处理5天后再以成骨培养基诱导7天，系统检测EndMT与成骨标志物，结合功能缺失、功能获得及回复实验，确认METTL3经m⁶A-IGF2-IGF2BP2-PI3K-Akt轴促进EndMT与成骨转分化，进而推动钙化表型。结论为METTL3与IGF2BP2稳定IGF2 mRNA，提示依赖m⁶A的机制激活PI3K-Akt通路并促进内皮细胞EndMT与成骨样转分化。其重要意义在于扩展了对糖尿病VC与动脉粥样硬化发病机制的认识，提示内皮细胞并非钙化过程中的被动受害者，而是通过主动转分化积极参与钙化发生发展，并为靶向METTL3及其下游通路的治疗策略提供理论依据。

关键技术方法：研究使用人主动脉内皮细胞（HAECs，购自武汉Procell公司），以33 mM HG处理并以β-甘油磷酸与抗坏血酸诱导成骨分化；采用慢病毒介导的shRNA敲低与IGF2过表达、荧光激活细胞分选建立稳定细胞模型；通过CCK-8、划痕迁移与DAPI核染色评估增殖与迁移；以茜素红S染色与钙比色法检测钙化；采用qRT-PCR与Western blot检测表达；以比色法测定整体m⁶A水平；通过RNA免疫沉淀（RIP）、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）及IGV可视化分析m⁶A富集；并以放线菌素D实验评估mRNA稳定性。

研究结果：（1）METTL3在HG诱导的EndMT与成骨分化中的作用：HG处理升高HAECs整体m⁶A修饰水平，shM3可逆转该变化；HG下METTL3表达显著上调并伴内皮标志物下降、间充质标志物升高，METTL3敲低可逆转HG诱导的EndMT，提示其在该过程中的关键作用。（2）METTL3介导HG加速成骨分化：HG+OM下茜素红染色与钙含量升高、成骨转录因子MSX2、OSX、Runx2上调，shM3可减弱上述钙化表型并降低OPN表达，提示METTL3经EndMT促进成骨程序化。（3）METTL3经激活PI3K-Akt通路促进HG下EndMT：HG单独处理增加PI3K/Akt磷酸化，shM3及PI3K抑制剂LY294002可逆转；PI3K激动剂740 Y-P可恢复shM3细胞中PI3K与Akt磷酸化及Vim、α-SMA表达，表明METTL3经该通路促进EndMT。（4）METTL3经IGF2介导的PI3K-Akt激活促进EndMT与成骨分化：HG上调IGF2 mRNA与蛋白，shM3可逆转；HG增加IGF2 mRNA的m⁶A修饰水平，RIP-qPCR显示METTL3结合IGF2 mRNA，IGV显示IP样本中IGF2相关m⁶A峰明显高于input；在shM3细胞中过表达IGF2可恢复PI3K-Akt活化、EndMT标志物及OPN、OSX、RUNX2、MSX2表达，茜素红染色进一步证实该表型。（5）METTL3经IGF2BP2依赖机制稳定IGF2 mRNA：shM3降低成熟IGF2 mRNA而非pre-IGF2，放线菌素D实验显示METTL3参与IGF2 mRNA稳定；在m⁶A阅读蛋白中仅IGF2BP2敲低降低IGF2表达，siIGF2BP2细胞中IGF2 mRNA衰减更快，RIP显示IGF2BP2结合IGF2 mRNA，提示其可能作为IGF2 mRNA的m⁶A阅读蛋白，但直接m⁶A依赖结合与功能必要性仍需进一步实验证实。

讨论与结论：讨论指出内皮细胞可经EndMT转分化为成骨表型，EndMT促进血管平滑肌细胞成骨与钙化，但内皮细胞成骨分化在糖尿病VC机制中的作用尚未充分阐明；本研究显示HG上调METTL3与m⁶A水平，敲低METTL3抑制EndMT、成骨分化与钙化，与既往糖尿病微血管并发症m⁶A修饰研究一致；PI3K与Akt磷酸化在HG下显著上调，METTL3敲低及PI3K抑制剂均可逆转，表明METTL3介导的m⁶A修饰通过激活PI3K-Akt通路促进内皮细胞成骨分化；IGF2BP家族中仅IGF2BP2结合IGF2并参与其蛋白表达，可能通过调控IGF2 mRNA稳定性或翻译实现。研究亦指出局限：基于HG模拟模型的结果需在动物模型与临床样本中验证，缺乏渗透压对照，其他血管细胞贡献有待探索，m⁶A动态修饰需时间维度分析，且功能缺失证据本身不能确证因果关系，但已有多个独立研究的功能获得证据支持METTL3的促钙化作用，仍建议补充内皮细胞功能获得研究。研究结论为：本研究提供证据表明METTL3与IGF2BP2稳定IGF2 mRNA，提示依赖m⁶A的机制激活PI3K-Akt信号通路并促进内皮细胞EndMT与成骨样转分化；这些发现不仅拓展了对糖尿病VC与动脉粥样硬化发病机制的认识，也为靶向METTL3及其相关通路应用于糖尿病心血管并发症提供了理论依据。