异甘草素通过群体感应与NADPH氧化酶双重调控干预慢性阻塞性肺疾病铜绿假单胞菌相关中性粒细胞胞外诱捕网形成

《Molecules》：Isoliquiritigenin Modulates Quorum Sensing-Associated Neutrophil Extracellular Trap Formation in COPD Isolate Pseudomonas aeruginosa

　　

研究人员表征了一种致病的慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD）分离株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）RS85，将其鉴定为中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的潜在诱导因子，并证明了异甘草素（Isoliquiritigenin, ISL）对细菌群体感应（Quorum Sensing, QS）及中性粒细胞反应的缓解作用。低剂量的ISL对P. aeruginosa RS85和PAO1表现出抗群体感应（Anti-Quorum Sensing, AQS）活性，而其高剂量则表现出杀菌作用。当用活的临床铜绿假单胞菌菌株及其分泌组处理时，中性粒细胞内的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）和中性粒细胞胞外诱捕网形成（NETosis）显著升高；而LasI/RhlI缺陷突变株PAO1-JP2诱发的反应则明显减弱。RS85的分泌组促进了小鼠肺内NET的形成、炎症细胞的募集、肺泡破坏以及肺气肿样病理改变。ISL的引入将细胞及分泌组介导的ROS和NETosis抑制至接近PAO1-JP2所诱导的水平。ISL处理限制了NETosis、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）与瓜氨酸化组蛋白H3（Citrullinated Histone H3, Cit H3）的共定位，并减轻了肺部炎症与结构损伤。ISL与细菌QS系统（LasR和RhlR）及中性粒细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶组装组分（p47phox和NOX2）蛋白的分子对接显示其具有强配体结合能力，证实了ISL对QS信号转导和ROS生成途径的干扰作用。该研究揭示了由QS调控的临床铜绿假单胞菌分泌型毒力因子驱动NETosis的潜在机制，并证明了ISL对NETs及细菌QS的缓解作用。

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球发病率和死亡率居高不下的重大公共卫生问题，其急性加重多由细菌感染驱动，可加速肺功能下降、延长住院时间并增加死亡风险。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为革兰阴性条件致病菌，凭借固有耐药性、强环境适应性及群体感应（Quorum Sensing, QS）系统调控的毒力因子，在COPD患者气道内持续定植并引发肺损伤。肺损伤不仅源于细菌的持续存在，更与宿主先天免疫反应失调密切相关。中性粒细胞作为气道内最先应答的免疫细胞，在受到刺激后常通过释放活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）和形成中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）发挥效应。然而，在COPD中，过度形成的NETs功能失调，与吞噬功能受损及微生物清除障碍相关；其DNA成分可激活cGAS/TLR9感知通路，促进NF-κB活化并释放IL-1β、IL-18等炎症介质，导致慢性炎症和组织破坏。因此，在抑制过度NETosis及相关炎症的同时保留宿主正常防御功能，成为潜在治疗方向。QS作为密度依赖的细胞间通讯网络，是铜绿假单胞菌毒力表达的关键调节因子，临床分离株通常较实验室菌株表现出更强的QS活性。异甘草素（Isoliquiritigenin, ISL）是一种具有抗氧化、抗炎和抗QS活性的天然查耳酮类化合物，但其在QS抑制背景下对宿主先天免疫及ROS介导NETosis的调控作用尚未明确。基于此，研究人员假设ISL可通过同时干扰细菌QS调控的毒力信号与ROS依赖的NETosis来调控宿主-病原体互作，并利用来源于COPD患者痰液的人类呼吸道分离株铜绿假单胞菌RS85作为模式病原体，开展了体外人源中性粒细胞及体内小鼠模型的系统性研究。

研究人员通过整合QS活性检测、N-酰基高丝氨酸内酯（N-Acyl Homoserine Lactones, AHLs）代谢组学、人外周血中性粒细胞功能实验、急性肺损伤动物模型及分子对接技术，系统评估了ISL对铜绿假单胞菌QS及中性粒细胞NETosis的双重调控作用。研究证实RS85可通过QS依赖方式诱导NETosis，而ISL在亚抑菌浓度下即可有效抑制QS表型并阻断NET形成，为开发针对铜绿假单胞菌感染的宿主定向疗法提供了实验依据。

本研究采用了多学科交叉的技术策略。在细菌学层面，利用纸片扩散法、分光光度法及Illumina MiSeq平台全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）评估ISL对QS依赖性色素的抑制效应并解析RS85的LasR和RhlR；通过液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）对细菌分泌组中的AHLs进行定性鉴定。在免疫学层面，从18名健康供者外周血分离人中性粒细胞，采用荧光显微镜、Hoechst染色、免疫荧光标记（针对MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase, NE）及Cit H3）及DCFH-DA（2',7'-二氯荧光素二乙酸酯）探针评估NETosis与细胞内ROS水平；利用N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine, NAC）和佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）分别作为ROS抑制和NETosis阳性对照。在体内验证方面，建立了6周龄Balb/c小鼠铜绿假单胞菌分泌组诱导的急性肺损伤模型，经鼻滴注给予细菌分泌组及ISL，通过苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色、组织学评分、平均线性截距（Mean Linear Intercept, MLI）测量及免疫荧光定量分析肺组织病理改变与NET负荷。此外，运用PyRx软件开展分子对接，预测ISL与LasR、RhlR及中性粒细胞NADPH氧化酶组分p47phox和NOX2的结合模式。

2.1 ISL抑制QS调控的色素产生

纸片扩散法显示，含ISL的纸片在C. violaceum ATCC 12472、PAO1及RS85周围形成色素抑制晕，范围分别为8 ± 0.25 mm、16 ± 0.5 mm和18 ± 0.5 mm；与阳性对照3H-furanone相比，ISL在亚抑菌浓度下即可抑制色素产生，而液体培养实验进一步表明ISL以剂量依赖方式抑制violacein和pyocyanin合成，对RS85的pyocyanin抑制在31.2 μg/mL即达显著水平，而高密度下才出现生长抑制，证实低剂量ISL具有特异性抗QS活性，高剂量则表现为杀菌作用。

2.2 ISL与LasR和RhlR的相互作用预测

对RS85的全基因组测序显示其与DSM 50071^T及PAO1的orthoANI值分别为98.8%和98.9%，LasR和RhlR与PAO1具有100%氨基酸序列一致性。分子对接结果表明，ISL可嵌入LasR和RhlR的配体结合腔，其中与LasR的预测结合能最高，达?11.1 kcal mol^?1，其芳香骨架与羟基分别占据疏水及极性区域；与RhlR的结合能相对较低，为?7.4 kcal mol^?1。该结果提示ISL可与QS信号转导的转录调控因子相互作用，尤以LasR为甚。

2.3 AHLs鉴定及NETosis驱动分子识别

LC-MS/MS分析在RS85和PAO1分泌组中共同鉴定出C₄-HSL（m/z: 298.64）和3-Oxo-C₁₂ HSL（m/z: 171.19），而3-OH-C₁₀-HSL（m/z: 273.38）为RS85所特有。等摩尔浓度（100 μM）的合成AHLs处理中性粒细胞均可触发胞外DNA释放，其中3-Oxo-C₁₂ HSL诱导的NETs量显著高于C₄-HSL、C₁₂-HSL及PMA处理组，表现出最强的NET诱导能力，提示其为AHL介导NET诱导的关键效应分子。

2.4 活菌及分泌组诱导NETosis和ROS生成

实验比较了PAO1野生型、lasI/rhlI缺失突变株PAO1-JP2及临床株RS85的活菌与其分泌组对人中性粒细胞的影响。结果显示PAO1-JP2无论细胞还是分泌组均不诱发明显NETs和ROS；而PAO1和RS85的活菌及分泌组均能显著激活NETosis与ROS生成，其中RS85分泌组诱发的反应最强。免疫荧光进一步显示RS85分泌组导致染色质广泛解浓缩及MPO与NE的高度共定位，证实菌株特异性差异与QS调控分泌产物驱动的过度NET形成密切相关。

2.5 ISL抑制细胞诱导的NETosis和氧化爆发

在RS85和PAO1活菌刺激体系中，ISL（125 μg/mL）显著抑制NETosis及DCFH-DA探针检测到的ROS生成；NAC预处理同样阻断PAO1诱导的NETs，证实ROS对NET形成必不可少。ISL单独处理不激活中性粒细胞，联合活菌处理后未出现NETs和ROS升高，其抑制趋势与细菌毒力正相关，RS85反应最强而被ISL最大程度抑制。

2.6 ISL减弱分泌组诱导的NETosis和ROS生成

用PAO1或RS85分泌组刺激中性粒细胞时，ISL共处理可显著降低NETs及ROS水平。PAO1分泌组诱导大量NETs，RS85分泌组反应更强；两者经ISL处理后，NETosis和ROS生成均被显著抑制至接近基线水平，表明ISL可阻断QS相关分泌因子触发的免疫激活。

2.7 ISL降低MPO和NE与中性粒细胞胞外DNA的共定位

免疫荧光分析表明，PAO1和RS85刺激后，ISL预处理可减少MPO和NE与胞外DNA的共定位及NET形成，该效应与NAC预处理类似，提示ISL通过减轻氧化应激阻碍NET成熟。

2.8 ISL未降低中性粒细胞活力

MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）检测和AO/EB（吖啶橙/溴化乙锭）染色显示，ISL在31.25–125 μg/mL浓度下未显著影响中性粒细胞活力；250 μg/mL时仅见极少量死细胞，而实验所选浓度125 μg/mL未引起显著细胞死亡，排除了ISL对NETosis和ROS的抑制效应源于细胞毒性的可能。

2.9 ISL保护肺部免受分泌组诱导的NET形成和损伤（体内）

在经鼻给予PAO1或RS85分泌组7天的小鼠模型中，肺组织细胞外DNA释放显著增加，RS85强于PAO1；ISL处理组则呈现与未诱导状态相似的细胞核形态，弥散染色显著减少。外周血中性粒细胞及肺组织的免疫荧光证实，ISL显著降低MPO和NE与DNA的共定位，有效抑制体内NETosis。

2.10 ISL改善暴露于铜绿假单胞菌分泌组的小鼠肺部病理改变

H&E染色及盲法组织学评分显示，RS85和PAO1分泌组引起气道周围及肺泡隔的炎症细胞浸润、增厚与破坏，组织学评分由对照组接近0分别升至约14；ISL处理组降至约5。平均线性截距（MLI）测量显示肺泡结构破坏：对照组约20 μm，RS85和PAO1组分别增至约48 μm和35 μm，而ISL处理恢复至约21 μm，表明其对肺气肿样病理具有显著改善作用。

2.11 ISL减少暴露于铜绿假单胞菌分泌组的小鼠肺部NETs

肺组织免疫荧光定量分析显示，RS85和PAO1分泌组处理后，Cit H3与MPO和DNA强烈共定位，NET阳性面积分别约45%和22%；经ISL处理后，RS85和PAO1组的NETosis分别降至约14%和7%，证实ISL在体内有效抑制肺组织NET形成。

2.12 ISL与p47phox和NOX2表现出有利的分子结合

分子对接预测显示，ISL可与吞噬细胞NADPH氧化酶复合体的调节亚基p47phox（结合能?7.787 kcal/mol，氢键供体包括ARG41、GLU44、GLU47和ASP119）及催化亚基NOX2（结合能?8.062 kcal/mol，与GLU215、ARG147、PHE145形成氢键，并与Leu163存在疏水相互作用）稳定结合。该结果提示ISL可能通过干扰NADPH氧化酶的组装或酶活性抑制氧化爆发，从而为其减少ROS和NETs形成提供结构基础。

研究人员在讨论中指出，COPD中的中性粒细胞反应常呈失调状态，表现为ROS和NETosis过度活化。尽管NETs参与气道微生物清除，但亦促进炎症与组织损伤。本研究证明ISL兼具抑制细菌QS毒力与调节宿主中性粒细胞炎症反应的双重功能。ISL通过抑制violacein和pyocyanin等QS依赖表型降低细菌致病潜力，而QS调控的毒力因子（如绿脓菌素）可通过氧化还原循环放大氧化应激并驱动NETosis。ISL的抗氧化活性不仅削弱病原体来源的刺激，还直接影响中性粒细胞内的ROS生成信号通路。减少ROS依赖的NETosis可能并非单纯抑制宿主防御，而是使免疫反应向更受控、有效的方向转化，在保留抗菌功能的同时限制组织损伤。体内研究进一步证实，ISL可显著改善分泌组诱导的肺组织病理与NET负荷。与直接杀菌策略不同，靶向QS有助于避免耐药选择压力；而ISL对p47phox和NOX2的预测结合则为其抑制NADPH氧化酶、减少ROS生成提供了分子层面的解释。尽管这些相互作用尚待实验验证，但ISL处理与NETosis减少之间的明确关联已得到充分支持。

研究结论部分翻译如下：该研究表明，ISL可能通过调节铜绿假单胞菌QS调控的毒力表型并调节中性粒细胞介导的炎症反应（包括ROS生成和NET形成），从而同时影响细菌毒力与宿主炎症反应。这些发现突显了ISL作为铜绿假单胞菌相关感染中靶向细菌毒力与宿主炎症反应的候选药物的潜力。然而，由于本研究仅使用了来自COPD患者的单一临床铜绿假单胞菌分离株以及来自健康供者的中性粒细胞，结果有待在更大的COPD队列中进一步验证，并需考虑供体间变异。此外，上述预测分子相互作用尚需实验验证，以支持进一步的机制推断和潜在应用。