双咪唑鎓衍生物3e–3g的胆碱酯酶与HIV-1逆转录酶抑制活性整合生化与计算评价

《Molecules》：Integrated Biochemical and Computational Evaluation of Bis-Imidazolium Derivatives 3e–3g in Cholinesterase and HIV-1 Reverse Transcriptase Assays

　　

对双咪唑鎓衍生物（3e、3f、3g）采用比色法测定与分子对接，评价其对乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）及人类免疫缺陷病毒1型逆转录酶（HIV-1 RT）的抑制活性。针对HIV-1 RT–3e复合物开展了100 ns分子动力学（MD）模拟与分子力学/广义Born表面积（MM/GBSA）分析。化合物3e为活性最强的衍生物，半数抑制浓度（IC50）最低：AChE为13.36 μg/mL，BChE为4.95 μg/mL，HIV-1 RT为50.44 μg/mL。奈韦拉平在20 μM时对RT的抑制率为95.33%。重对接验证了结合构象，均方根偏差（RMSD）低于2.0 ?，但对接评分与实验活性排序缺乏一致相关性。在MD轨迹中，3e在RT结合口袋内保持稳定，MM/GBSA能量为?51.04 ± 8.39 kcal/mol。吸收、分布、代谢、排泄与毒性（ADMET）预测显示胃肠道吸收低、无血脑屏障渗透，并存在高置信度的人ether-à-go-go相关基因（hERG）钾通道阻断警示。上述结果提示3e值得进一步优化。

研究背景与问题 阿尔茨海默病（AD）为进行性神经退行性疾病，淀粉样蛋白导向疗法虽已拓展治疗格局，但疗效局限与不良事件使胆碱能调节等策略仍受关注。AChE与BChE是研究影响乙酰胆碱水解化合物的既定靶点；HIV-1 RT在将病毒RNA基因组转化为DNA中起核心作用，非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）经变构口袋发挥作用，耐药相关氨基酸替换可削弱其活性，故寻找替代化学骨架仍属必要。含咪唑结构为酶抑制研究提供通用骨架，已有报道显示带两个正电荷的咪唑鎓盐及含2-氧化吲哚骨架的咪唑鎓衍生物可抑制AChE，咪唑-酰胺联芳醚系列对野生型HIV-1及NNRTI耐药Y188L变异体显示活性。本研究化合物源于既往报道的合成与表征工作，该系列双咪唑鎓溴化物3a–3g曾评价抗肿瘤与抗菌活性，其中3e、3f、3g分别带辛基、壬基、癸基取代，但其对AChE、BChE及HIV-1 RT的抑制谱尚未界定，且既往细胞毒性提示须明确酶活性与选择性。因此研究人员在三个酶系统上对结构相关的同系物开展系统表征，以明确该系列的抑制谱、考察烷基链长与活性的关系，并形成指导后续实验评估与化学优化的结构假设。

关键技术方法 采用改良Ellman比色法测定重组人AChE抑制活性（多奈哌齐为阳性对照），以丁酰胆碱酯酶活性试剂盒（比色法）测定马血清来源BChE抑制活性并进行样本背景校正，以罗氏比色法逆转录酶试剂盒（基于生物素与地高辛标记核苷酸掺入、链霉亲和素捕获及抗地高辛过氧化物酶抗体检测）测定HIV-1 RT抑制活性（奈韦拉平为参照）。IC₅₀经GraphPad Prism非线性回归（可变斜率归一化响应模型）估计，置信区间用轮廓似然法计算。分子对接采用AutoDock Vina 1.2.7并以共结晶配体（多奈哌齐E20、HUN、奈韦拉平NVP）重对接验证；对HIV-1 RT–3e复合物开展GROMACS 2024.1单条100 ns轨迹的MD模拟及gmx_MMPBSA的MM/GBSA与逐残基分解；理化性质与ADMET由SwissADME与Deep-PK预测。晶体结构取自蛋白质数据库（AChE：4EY7；BChE：6QAA；HIV-1 RT：3LP1）。

2.1 对AChE与BChE的抑制 三种衍生物均呈浓度依赖性抑制，3e对两种酶的IC₅₀最低，其次为3g与3f，两测定中活性排序一致。AChE的IC₅₀分别为13.36、41.59、25.99 μg/mL，3e较3f低约3.1倍、较3g低约1.9倍；多奈哌齐IC₅₀为0.048 μg/mL，效力显著更高。BChE中3e与3g的IC₅₀相近（4.95与5.32 μg/mL），3f为17.44 μg/mL，3e较3f低约3.5倍。各化合物对BChE的IC₅₀均低于AChE，AChE/BChE比值约2.7、2.4、4.9，但因两酶测定形式不同，不宜解读为酶选择性直接度量。由此提示烷基链延长并不带来一致的抑制增强，链长可能影响带电基团的空间排布及其在结合区的容纳。

2.2 对HIV-1 RT的抑制 三种化合物在非放射性ELISA法中呈浓度依赖性抑制，IC₅₀分别为50.44、710.5、532.5 μg/mL，3e较3f低约14.1倍、较3g低约10.6倍。奈韦拉平在20 μM时抑制率为95.33%，该单浓度参照仅提供测定基准，不能用于基于IC₅₀的效力比较。3e的突出活性提示结构变化显著影响RT抑制，可能改变构象偏好与相互作用基团定位；但IC₅₀仅描述测定条件下的抑制效力，不确立抑制机制，3e不能据此归为NNRTI。RT测定的活性排序与两种胆碱酯酶一致，3e在三个酶中均为最活跃衍生物，故被选作结构研究重点。需注意各酶测定均为单次实验运行内三个技术重复，所报变异反映批内技术变异，批间重现性未评估；化合物特异性干扰未在三种比色测定中全面评估。

2.3 分子对接结果与结合构象分析 重对接中奈韦拉平、多奈哌齐与HUN的重原子RMSD分别为0.193、0.360与1.977 ?，均满足RMSD < 2.0 ?的构象回收标准，但这仅表明所选条件下参考构象可被再现，并不独立验证3e–3g的预测结合模式。三种化合物在各靶标均获负Vina评分，HIV-1 RT为?8.586至?8.237 kcal/mol，AChE为?8.588至?8.413 kcal/mol，BChE为?8.004至?7.750 kcal/mol；3g在RT与AChE评分最优，3f在BChE居首，但靶内评分区间狭窄，对接未能有效区分这些近缘衍生物，且评分与实验活性排序不一致，限制了基于亲和力的解读。HIV-1 RT–3e预测构象位于奈韦拉平相关结合区，邻近A链Leu100、Val106、Tyr181、Tyr188、Trp229及B链Glu138，作用图显示与Tyr188、Trp229、Thr139的π–sigma接触及烷基、π–烷基与范德华接触，并与A链Glu169形成吸引电荷作用、与B链Glu138形成碳–氢键。AChE复合物中3e占据Trp86、Tyr124、Trp286、Tyr337、Phe338邻近的峡谷区，与Trp286呈π–π堆积、与Glu202呈吸引电荷作用，并与Tyr72、Gly121、Ser293形成碳–氢键。BChE–3e构象在Trp82、Ser198、Leu286、Phe329、Tyr332、His438围成的区域呈芳香与极性接触组合，与Tyr332呈π–π堆积、与Trp231呈π–sigma作用、与Glu197呈吸引电荷作用。总体上3e可采取靶标依赖的构象，其优先地位由实测活性决定，对接仅提供结合假设。

2.4 MD模拟与HIV-1 RT–3e复合物的动态稳定性 在显式溶剂与动态柔性环境中对复合物开展100 ns模拟。蛋白骨架RMSD全程较低，100 ns平均为0.236 ± 0.025 nm，后50 ns为0.241 ± 0.022 nm；A链与B链分别为0.234 ± 0.036与0.204 ± 0.015 nm，支持异二聚体结构保持。配体3e经骨架对齐后RMSD全程平均0.267 ± 0.045 nm，后50 ns为0.262 ± 0.047 nm，最大偏差0.447 nm，轨迹末段无持续升高，表明其始终与对接定义结合区相结合。Cα RMSF全蛋白平均0.142 ± 0.071 nm，柔性升高局限于A链残基66–69、135–140、285–291及B链6–7、358–359等离散片段，最灵活位点包括A链Glu138、Asn137、Thr139、Asn136与B链Glu6、Thr7。回旋半径（Rg）100 ns平均3.510 ± 0.024 nm，后50 ns略降至3.500 ± 0.021 nm；溶剂可及表面积（SASA）由486.52 ± 7.05 nm²降至482.29 ± 5.27 nm²，未见明显结构膨胀或解折叠。蛋白–配体氢键较为间断，平均0.349 ± 0.477个，后50 ns为0.257 ± 0.438个，约34.9%轨迹存在至少一个氢键，说明其动态稳定性不依赖持续氢键网络。上述结果均限于单条轨迹，不确立收敛性、长期结合稳定性或独立模拟间的可重复性。

2.5 MM/GBSA分析 对50–100 ns平衡段以100 ps间隔取501个快照计算，复合物总结合能估计为?51.04 ± 8.39 kcal/mol。分项显示范德华作用为最强有利贡献（ΔE_vdW = ?68.06 ± 10.00 kcal/mol），非极性溶剂化亦有利（ΔG_SA = ?8.20 ± 1.44 kcal/mol），直接静电项不利（ΔE_ele = +89.57 ± 19.26 kcal/mol），但被广义Born极性溶剂化（ΔG_GB = ?64.35 ± 19.43 kcal/mol）大幅抵消；范德华与非极性合计约?76.26 kcal/mol，静电与极性溶剂化合计净不利约+25.22 kcal/mol，表明结合有利性主要源于色散、紧密堆积与非极性作用。逐残基分解显示最有利贡献来自Tyr188（?2.38 kcal/mol）、Tyr181（?2.29）、Leu100（?2.04）、Val179（?1.98）、Tyr318（?1.51）与Leu234（?1.31），Gly190、Trp229、Val189、Val106亦有稳定贡献，其中多个残基为NNRTI疏水结合环境的既定组成，Tyr181与Tyr188为耐药相关位点；这些残基的有利贡献主要由负范德华项主导。Lys101（约+0.82 kcal/mol）与Arg172（约+0.22 kcal/mol）净贡献略不利，反映静电与去溶剂化的强补偿。该结果属近似端点能量估计，受单轨迹采样、隐式溶剂近似及未计构象熵限制，对双阳离子3e亦对电荷赋值与介电处理敏感。

2.6 预测的理化与ADMET性质 SwissADME与Deep-PK输出显示随烷基链延长出现系统性理化变化，3e兼具最低分子量与柔性及最低共识logP，氢键计数与拓扑极性表面积（TPSA）不变，两种溶解度模型均将3e排为较其长链类似物更易溶。未见PAINS警示，三者肝损伤分类均为阴性；3e的Ames分类为阴性而3f、3g为阳性（置信度低）。按Lipinski标准，3e与3f各有一项违反，3g为两项。预测的低胃肠道吸收不利于口服暴露，缺乏血脑屏障渗透性削弱了直接中枢胆碱酯酶抑制的依据，HIV-1 RT抑制相关的细胞暴露亦未验证；高置信度hERG阳性预测为潜在心脏安全关切，需实验评估。SwissADME与Deep-PK在CYP2D6抑制上的分歧进一步提示预测不确定性；这些永久带电双阳离子化合物在模型训练域中的代表性尚未确立，故上述结果仅识别潜在开发风险，而非确立药代或安全性特征。

讨论与结论 本研究显示双咪唑鎓衍生物3e–3g对AChE、BChE与HIV-1 RT呈浓度依赖性抑制，3e在所测系列中IC₅₀最低（分别为13.36、4.95与50.44 μg/mL）。重对接再现了参考配体构象，而对接评分区分近缘化合物能力有限且与实验活性排序不完全吻合。在单条100 ns MD轨迹中3e保持于预测的HIV-1 RT结合区，MM/GBSA估计为?51.04 ± 8.39 kcal/mol，未计入显式构象熵贡献。ADMET预测提示低胃肠道吸收、无预测血脑屏障渗透及潜在hERG阻断风险。综上，结果确定3e为该系列最活跃衍生物并为进一步评价提供基础；但这些发现不确立细胞抗病毒效力、实验结合亲和力或独立MD轨迹间的可重复性，细胞抗病毒活性与选择性仍未确认，需开展配对的细胞毒性评估的细胞水平抗病毒试验。