《Molecules》：Metabolomics-Based Analysis Reveals Differences in Non-Volatile Components of Artemisiae argyi Folium with Different Aging Durations
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艾叶（Artemisiae argyi Folium，AAF）传统认为陈化越久品质越优，但不同陈化时长下非挥发性代谢组的差异仍缺乏系统表征。研究人员采用超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱（UPLC-Orbitrap-MS/MS）正离子模式结合代谢组学
艾叶（Artemisiae argyi Folium，AAF）传统认为陈化越久品质越优，但不同陈化时长下非挥发性代谢组的差异仍缺乏系统表征。研究人员采用超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱（UPLC-Orbitrap-MS/MS）正离子模式结合代谢组学策略，分析0至7年共8组AAF样本，共注释138个化合物。主成分分析（PCA）与偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示各组代谢轮廓明显分离；进一步筛选出48个差异代谢物，经Mfuzz聚类分为三类时间模式：整体下降型、中晚期富集型与早中期富集型。研究人员从中选出9个探索性候选标志物，包括山奈酚、芹菜素、木犀草素、芦丁、七叶内酯、异嗪皮啶、阿魏酸、argyinolide H与matricarin。结果表明，AAF非挥发性代谢物随陈化时长呈复杂非单调变化，而非单一线性趋势，该研究为陈化年限判别与质量评价提供了代谢组学基础与候选化学标志物。
研究背景与立题依据
艾叶为菊科蒿属植物艾（Artemisia argyi Lévl. et Vant.）的干燥叶，传统医学认为其“陈久者良”，具有温经止血、散寒止痛等功效。现代研究表明，艾叶富含挥发油、黄酮（flavonoids）、酚酸（phenolic acids）、香豆素（coumarins）、萜类（terpenoids）及多糖等活性成分。既往关于艾叶陈化研究多集中于挥发油、总黄酮或总多糖含量，或仅选取1、3、5年等非连续时间点，对0至7年连续陈化过程中非挥发性小分子代谢组的动态演变缺乏系统解析。由于陈化期间水解、氧化与异构化等反应会重塑化学成分轮廓，传统整体含量指标难以反映其时空特异性变化。因此，研究人员开展本研究，旨在明确非挥发性代谢物是否随陈化时长发生显著改变，并筛选可区分不同陈化年限的探索性候选标志物，为艾叶陈化质量评价提供化学基础。
研究人员以采自河南南阳同一产区、同年际采收并自然陈化0至7年的艾叶为样本队列，每组建3个生物学重复，采用非靶向代谢组学手段完成成分注释、差异筛选与标志物的探索性识别。
主要关键技术方法
研究人员构建0、1、2、3、4、5、6、7年共8组陈化艾叶样本队列（每组n=3），使用甲醇提取非挥发性成分，经超高效液相色谱串联Orbitrap高分辨质谱（UPLC-Orbitrap-MS/MS）正离子模式采集数据；通过Compound Discoverer进行峰对齐与注释，结合主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、置换检验与PERMANOVA评估组间差异；采用|log2FC|>1且FDR<0.01筛选差异代谢物，并以VIP≥1交叉确认，继而用Mfuzz聚类刻画时间轨迹，最终依化学类群覆盖与时效模式遴选探索性候选标志物。
研究结果
非挥发性代谢物轮廓与注释：研究人员于正离子模式下共疑似注释138个非挥发性代谢物，涵盖47个黄酮、37个萜类、13个氨基酸及其衍生物、10个木脂素与香豆素、7个酚酸、6个脂质、4个有机酸及14个其他类。结果表明艾叶非挥发性化学组成以黄酮和萜类为主导。
不同陈化时长样本的多变量分析：PCA中PC1与PC2累计解释56.4%方差，鲜叶与陈化样本明显分开，1至3年样本聚拢，4至7年形成独立簇；PLS-DA模型R2X=0.80、R2Y=0.57、Q2=0.56，置换检验支持模型有效；以陈化年限为连续变量的PLS回归R2Y=0.96、Q2=0.92。结论为陈化时长与非挥发性代谢轮廓显著关联，且3年至4年间存在明显组成转变。
候选差异代谢物的筛选与分析：28组两两比较中，按|log2FC|>1、FDR<0.01及VIP≥1共确定48个差异代谢物。Mfuzz聚类将其分为三型：簇1（11个）鲜叶高、陈化后走低；簇2（25个）4年后升高并维持，含山奈酚、木犀草素、芦丁等黄酮；簇3（12个）早期升高、后期波动，含argyinolide H与matricarin等萜类。说明代谢变化非单调，而具阶段特异性。
探索性候选标志物相对丰度：研究人员选出9个代表物——4黄酮（山奈酚、芹菜素、木犀草素、芦丁）、2香豆素（七叶内酯、异嗪皮啶）、1酚酸（阿魏酸）、2萜类（argyinolide H、matricarin）。七叶内酯与芹菜素鲜叶偏高后降；山奈酚等中晚期富集；argyinolide H等早期富集、7年回升。结果显示单标志物不足以刻画陈化差异，需多标志物组合。
讨论部分总结
讨论指出，黄酮为AAF非挥发性组分核心类群，其阶段化重塑与既往多糖、挥发油研究一致；3年至4年间的代谢分离应理解为横断面差异，因收获年份与陈化时长在本设计中未能完全解耦，尚不能断言存在严格“三年阈值”。九大候选标志物覆盖不同化学类与时效模式，较单标记更能描述非单调变化，但仍属探索性，需经标准品确证、绝对定量与药理活性验证方可用于年限判定。
结论部分翻译
本研究采用正离子模式UPLC-Orbitrap-MS/MS非靶向代谢组学，表征0至7年8组AAF的非挥发性代谢物，共疑似注释138个代谢物，48个差异代谢物呈现三类陈化关联模式；选出含4黄酮、2香豆素、2萜类与1酚酸的9个探索性候选标志物。不同陈化时长AAF的整体非挥发性代谢轮廓差异显著，其相对丰度呈复杂非单调模式而非一致单向趋势。该研究刻画了不同陈化史AAF的组成差异，并为后续批次区分与陈化时长相关变异研究提供了探索性化学数据与初步候选代谢物集合。未来应引入标准品身份确认、绝对定量及药理活性评价，以厘清候选标志物与陈化时长的定量关系，推动AAF陈化评价由整体代谢轮廓走向可验证的化学质量评估。
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