双子矩阵 PARAFAC 辅助 EEM 荧光法免色谱同时测定人尿中 NOR 与 MET：克服 40:1 浓度失衡的极简前处理策略

《Molecules》：PARAFAC-Assisted Excitation–Emission Matrix Fluorescence for Minimal-Preparation Co-Determination of Norfloxacin and Metoclopramide in Human Urine: Overcoming Severe Concentration Imbalance Without Chromatography

人尿中诺氟沙星（NOR）与甲氧氯普胺（MET）的直接同时测定受到强烈生物自发荧光、光谱重叠以及临床联合给药所致极端浓度差异（400 mg NOR 对 10 mg MET；剂量比 40:1）的严重制约。多向化学计量学为解析荧光团提供了免色谱途径，但生物背景和极端浓度差异可使全局 PARAFAC 建模复杂化。在此，研究人员证明，在人尿仅用 pH 3.0 水相缓冲液进行 10 倍稀释后，采用双子矩阵激发–发射矩阵（EEM）PARAFAC 策略可完全克服该局限，无需萃取、衍生化和有机溶剂。通过将测得的 EEM 阵列划分为两个专用子阵列（X_NOR：λ_ex 260–310 nm，λ_em 440–500 nm；X_MET：λ_ex 260–310 nm，λ_em 380–410 nm），可规避秩亏、消除旋转模糊性并完全保持三线性。加标尿液中外部校准得到 NOR 线性动态范围 1000–6000 ng mL^?1（R² = 0.9981）和 MET 15–80 ng mL^?1（R² = 0.9995）。在独立测试混合物中验证显示，NOR 和 MET 的平均回收率分别为 100.79 ± 4.57% 和 101.86 ± 4.06%，预测根均方误差（RMSEP）分别为 144.65 和 2.38 ng mL^?1。净分析物信号（NAS）品质因子表明高灵敏度，检测限分别为 119.87 ng mL^?1（NOR）和 3.16 ng mL^?1（MET）。该验证方法成功应用于五名健康志愿者口服商业片剂（Noracin? 400 mg 和 Primperan? 10 mg）联合给药后的尿排泄监测，72 h 内分别回收给药剂量 24.89 ± 4.63%（NOR）和 13.59 ± 9.27%（MET）。多指标绿色度和实用性评估（AGREE：0.68，ComplexMoGAPI：69，CaFRI：63.1，BAGI：75.0）证实其相对于传统色谱工作流具有显著可持续性优势。本研究使 PARAFAC 作为超绿色、免色谱工具在现代药物生物分析中焕发新生。

研究背景与问题：诺氟沙星（NOR）为广谱氟喹诺酮类抗菌药，甲氧氯普胺（MET）为多巴胺 D₂ 受体拮抗剂和 5-HT₄ 激动剂，二者可在食源性细菌性胃肠炎相关临床场景中联合给药。人尿中同时测定二者是临床药代动力学、治疗药物监测和生物等效性评价的重要基础。然而，临床剂量差异导致尿中浓度严重失衡（常超过 75:1），且尿液内源性荧光团产生强烈、宽谱自发荧光，加上 NOR 与 MET 光谱重叠，使直接荧光测定困难。已报道方法多依赖高效液相色谱（HPLC）或液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS），虽为金标准但存在运行时间长、仪器成本高、色谱柱污染和有机溶剂消耗大等问题；已有分光光度法和荧光法多分别测定单药。全局 PARAFAC 在极端浓度差异和尿液背景存在时易出现秩亏、旋转模糊性和三线性丢失。因此，研究人员提出双子矩阵 EEM-PARAFAC 策略，以期在极简前处理下实现免色谱同时定量，并兼顾绿色分析化学要求。

研究人员开展的研究与总体结论：研究人员将 EEM 数据划分为 X_NOR 与 X_MET 两个专用子阵列，分别建立 PARAFAC 外部校准模型，在 pH 3.0 水相缓冲液 10 倍稀释尿样中直接测定 NOR 和 MET；方法参照 ICH M10 生物分析原则验证，并应用于健康志愿者口服 Noracin?（400 mg NOR）与 Primperan?（10 mg MET）后的 72 h 尿排泄监测，同时采用 AGREE、ComplexMoGAPI、CaFRI 和 BAGI 进行绿色度与实用性评价。总体结论是：双子矩阵策略可恢复三线性、消除旋转模糊性并克服 40:1 至 75:1 的浓度失衡，实现无需萃取、衍生化、有机溶剂和色谱分离的可靠同时定量，并显示出显著生态、经济和操作优势。

关键技术方法（≤250字）：方法上，研究人员以 pH 3.0 0.1 M 磷酸盐缓冲液将尿样 10 倍稀释后直接采集 EEM 荧光；将全 EEM 划分为 X_NOR（λ_ex 260–310 nm，λ_em 440–500 nm）和 X_MET（λ_ex 260–310 nm，λ_em 380–410 nm）两个子矩阵，分别建立 PARAFAC 模型，以外标法回归样本载荷，用核心一致性诊断（CORCONDIA）和 %Fit 选择因子数；以净分析物信号（NAS）计算方法性能指标；按 ICH M10 考察基质因子和冻融稳定性；用 AGREE、ComplexMoGAPI、CaFRI 和 BAGI 评估绿色度与实用性。样本来源为五名健康成年男性志愿者口服 Noracin?（400 mg NOR）与 Primperan?（10 mg MET）后 72 h 定时尿样（伦理批准号 201608RH1）。

研究结果：2.1 光谱性质与参数优化：通过光谱扫描和介质条件考察发现，MET 激发峰为 310 nm、发射峰为 360 nm，NOR 激发峰为 280 和 320 nm、发射峰宽约 450 nm，空白尿背景覆盖 λ_ex 260–340 nm 与 λ_em 380–520 nm。MET 在 pH 3.0 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液中发射最强，pH < 2.0 因过度质子化而猝灭，pH > 4.5 因中性种形成而信号近消失；NOR 在 pH 3.0 稳定。有机改性剂降低 MET 强度并增加基线噪声，故选用纯水相 pH 3.0 缓冲液。

2.2 光谱重叠、基质干扰与双子矩阵 PARAFAC 解析：通过 EEM 叠加和全局建模发现，NOR 发射与尿背景广泛重叠，MET 发射尾端被 NOR 发射覆盖；全局 PARAFAC 仅收敛出 NOR 和尿背景，无法分离 MET，截断数据又抑制 NOR 回收。采用双子矩阵后，X_MET 以 F = 3（MET、残余 NOR 尾、尿背景）获得 CORCONDIA = 94.2%、Fit = 99.85%，F = 4 时 CORCONDIA 降至 38.6%；X_NOR 以 F = 2（NOR、尿背景）获得 CORCONDIA = 98.7%、Fit = 99.92%。通过缓冲液空白扣除和光谱窗口边界选择消除散射干扰。与二阶标准加入法（SOSAM）比较，双子矩阵 PARAFAC 达到相当准确度，但每样约 1.0 min，且无需每样至少 3 次加标。

2.3 校准性能、验证与品质因子：通过 10 个校准加标尿样和 5 个外部验证混合物，NOR 在 1000–6000 ng mL^?1 内 R² = 0.9981，MET 在 15–80 ng mL^?1 内 R² = 0.9995；校准根均方误差分别为 70.77 和 0.86 ng mL^?1，平均校准回收率为 99.81 ± 1.83% 和 99.95 ± 2.58%；外部验证平均回收率为 100.79 ± 4.57% 和 101.86 ± 4.06%，RMSEP 为 144.65 和 2.38 ng mL^?1。NOR 与 MET 的灵敏度分别为 1.12 和 1.96，选择性分别为 0.42 和 0.15，检测限为 119.87 和 3.16 ng mL^?1，定量限为 363.23 和 9.56 ng mL^?1。六个供体尿空白基质因子 %CV 均低于 ICH M10 阈值，三循环冻融回收率为 96.40–101.65% 且 CORCONDIA 保持 >98%。MET 的选择性 0.15 表明其 85% 方差与背景重叠，但二阶优势仍可解析；正常生理波动至 2.5 倍基线可被隔离，偏差 <4.5%，而严重血尿或高胆红素血症、大量蛋白尿（>3 g L^?1）及高荧光药物共给药可破坏三线性，可通过提高稀释倍数或 0.22 μm PTFE 过滤恢复。

2.4 人体尿排泄谱应用：通过五名健康志愿者口服 Noracin?（400 mg）与 Primperan?（10 mg）后 72 h 定时尿样分析，NOR 排泄率峰值 13.38 ± 1.85 mg h^?1（中点 2.5 h），MET 峰值 160.84 ± 18.25 μg h^?1（中点 1.5 h），排泄在 48 h 基本完成；72 h 累计排泄 NOR 为 116.54 ± 18.51 mg（24.89 ± 4.63% 剂量），MET 为 1.74 ± 0.92 mg（13.59 ± 9.27% 剂量）。由于未对志愿者样品进行色谱参比分析，该数据本身不能建立与色谱法的定量一致性。

2.5 多指标绿色、白色和蓝色分析化学评估：通过 AGREE、ComplexMoGAPI、CaFRI 和 BAGI 评估，得分分别为 0.68、69、63.1 和 75.0，显示方法在极简样品制备、无有害萃取溶剂、低能耗和快速分析方面具优势。与已报道 HPLC、HPLC-FLD 和 LC-MS/MS 方法比较，该方法消除有机溶剂消耗、将样品前处理由约 30 min 缩短至 2 min、无需色谱柱，并具有更高绿色度和实用性评分；临床转化仍面临三维荧光仪普及度和化学计量学编程门槛，但仪器成本较低，可通过编译图形用户界面、云处理和 96 孔板自动化降低门槛。

讨论总结与研究结论（译述）：讨论表明，该方法的优势在于以数学色谱替代物理色谱，在极简稀释后直接解析复杂尿基质中的目标物；局限包括 MET 选择性较低、异常尿液基质可破坏三线性以及未进行色谱参比验证。研究结论为：本研究以双子矩阵光谱分区策略（X_NOR 与 X_MET）解决了生物自发荧光背景下大浓度差异分析物的解析难题；NOR 与 MET 在人尿中经 pH 3.0 水相缓冲液简单 10 倍稀释后，在 40:1 至 75:1 浓度差异下实现可靠定量，完全消除有毒有机溶剂、固相萃取和色谱分离，符合绿色样品制备进展；该方法参照 ICH M10 原则验证，在个体人尿基质中表现稳健，并成功追踪健康志愿者口服 Noracin?（400 mg）和 Primperan?（10 mg）后的 72 h 尿排泄动力学；多工具可持续性评估证实其相对于传统 HPLC 和 LC-MS/MS 平台具有显著生态、经济和操作优势；该工作使 PARAFAC 作为药物生物分析和质量控制中的超绿色工具焕发新生，并为机器人/流动注射自动化、PARAFAC2、交替三线性分解（ATLD）和物理信息神经网络张量分解，以及向血浆、血清和唾液等复杂生物基质扩展提供了方向。