负载银纳米颗粒与β-谷甾醇的聚乙烯醇/壳聚糖静电纺纳米纤维表现出优异抗菌效果

《Nanomaterials》：Electrospun PVA/Chitosan Nanofibers Containing AgNPs and β-Sitosterol Exert Superior Antibacterial Effect

　　

由于银纳米颗粒（AgNPs）具有公认的强大抗菌特性，它们常被用于伤口敷料中以预防细菌感染。β-谷甾醇（BST）是一种植物源植物甾醇，可通过其抗氧化、抗炎和促血管生成特性进一步支持伤口愈合过程。在本研究中，研究人员构建了一种用于其潜在伤口愈合应用的新型递送系统。通过静电纺丝法制备了负载有BST和AgNPs的聚乙烯醇/壳聚糖（PVA/CS）纳米纤维。研究人员发现这种合成的PVA/CS/AgNPs/BST纳米纤维系统符合所负载成分的理想尺寸、形貌、包封效率和释放时间过程，如扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、高效液相色谱（HPLC）和X射线衍射（XRD）分析所证实。抑菌圈（ZOI）试验表明，所构建的纳米纤维系统比单独的AgNPs或PVA/壳聚糖空白纤维对细菌生长具有显著更强的抑制作用。具体而言，AgNPs以及AgNPs + BST对金黄色葡萄球菌菌株ATCC 29213、43300和BAA-977表现出显著的抗菌活性，其最低抑菌浓度（MIC）值分别为62.5、62.5和31.2 μg/mL。同样，AgNPs和AgNPs + BST对铜绿假单胞菌菌株ATCC 27853和MDR-7067表现出抗菌活性，其MIC值分别为31.2 μg/mL和15.6 μg/mL。相比之下，BST对所研究的任何细菌菌株均未表现出细菌生长抑制作用。相容性分析表明，用AgNPs和AgNPs + BST处理的HFF1细胞在至少15.6 μg/mL和31.2 μg/mL浓度下均未显示出细胞毒性效应，而BST单独对细胞活力无影响，即使在较高浓度下也是如此。综上所述，这些数据表明PVA/壳聚糖/AgNPs/BST系统对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出更强的细菌生长抑制作用，凸显了其在伤口愈合中的潜在应用，但需经体内验证。

静电纺丝纳米纤维因其能够模拟天然细胞外基质（ECMs）并具备高比表面积、高孔隙率及良好柔韧性，已成为伤口愈合与组织工程中药物递送系统的理想载体。这类材料不仅有利于细胞黏附、生长与分化，还可吸收伤口渗出液并维持湿润的愈合微环境。然而，现有聚合物基伤口敷料纳米纤维往往面临机械性能欠佳及抗菌性能不足的瓶颈，难以有效预防创面感染。银纳米颗粒（AgNPs）具备广谱抗菌活性、良好的化学稳定性，且对多重耐药病原菌及生物膜形成菌表现出显著的抑制与杀灭能力；β-谷甾醇（BST）作为一种植物源植物甾醇，具有抗氧化、抗炎和促血管生成等生物学活性，在促进创面修复与减少瘢痕形成方面展现出良好应用前景。基于此，研究人员首次将BST与AgNPs共同包载于聚乙烯醇/壳聚糖（PVA/CS）纳米纤维中，旨在通过二者的功能协同构建一种兼具高效抗菌与促愈合特性的新型伤口敷料递送系统。

为构建该体系，研究人员采用静电纺丝技术制备了系列PVA/CS纳米纤维，并系统优化了聚合物比例（80/20、70/30、60/40、50/50）及对应电压参数，最终确定80/20配比为最优纺丝条件。研究所用到的主要关键技术方法包括：利用扫描电子显微镜（SEM）与透射电子显微镜（TEM）表征纤维形貌及AgNPs的分布状态；采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线衍射（XRD）分析药物与基质的相互作用及晶态变化；运用紫外-可见分光光度法（UV–Vis）与高效液相色谱（HPLC）分别定量AgNPs与BST的载药量（DL）及包封率（EE）；通过体外释放实验评估两种活性成分的释放动力学；采用最低抑菌浓度（MIC）测定与抑菌圈（ZOI）试验系统评价抗菌谱及效能；并评估人包皮成纤维细胞（HFF1）的体外细胞相容性。研究样本队列来源包括金黄色葡萄球菌标准株（ATCC 29213、ATCC 43300、ATCC BAA-977）、铜绿假单胞菌标准株（ATCC 27853）以及来源于临床菌株库的多重耐药铜绿假单胞菌（MDR 7067）。

研究结果部分如下：

3.1 负载纤维的形貌表征：SEM观察发现，当PVA/CS比例为50/50时，纤维中出现大量串珠结构；随着PVA比例升高至60/40和70/30，纤维逐渐拉长，串珠减少；当比例为80/20时，纤维形成表面光滑、直径均匀的规整结构，且易于从铝箔上完整剥离，据此确定80/20为最优纺丝配比。

3.2 负载纳米纤维的形貌评估：SEM与TEM结果显示，空白PVA/CS纤维表面光滑且串珠极少，平均直径325.9 ± 35.8 nm；BST单载后纤维直径增至451.2 ± 37.4 nm，可能因溶液黏度改变及聚合物与BST间相互作用增强所致；AgNPs单载后纤维直径降至305.5 ± 35.2 nm，归因于AgNPs提高了溶液导电性；BST/AgNPs共载后形成直径383 ± 30.8 nm的规整均匀纤维毡。TEM进一步证实约15 nm的AgNPs球形颗粒均匀分散于纤维内部及表面。宏观图像显示含AgNPs的纤维呈黄色，所有纤维膜均为连续自支撑结构，无裂纹或相分离。

3.3 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析：FTIR证实各组分成功包载且未破坏聚合物基质化学结构。BST的O-H伸缩振动峰约3400 cm^-1，脂肪族CH₂振动峰位于2850–2950 cm^-1，CH₂弯曲及C-O伸缩振动峰约1460 cm^-1和1313 cm^-1；复合纤维中相关特征峰发生位移或强度变化，表明BST与AgNPs被有效包封于纤维中。

3.4 X射线衍射（XRD）评估：PVA在2θ约20°处呈半结晶衍射峰，CS在2θ约20°和10°处呈宽化弥散衍射，BST与AgNPs则显示明显尖锐的结晶衍射峰。负载后复合纤维的衍射峰强度显著降低且峰形变宽，BST与AgNPs的特征结晶峰消失或明显减弱，提示药物以无定形或分子分散状态存在于纤维基质中。

3.5 银纳米颗粒的载药量和包封率测定：基于UV–Vis标准曲线（R² = 0.9995），AgNPs整体包封率为84.6%，载药量为3.64 μg/mg，三批样品间结果相近，表明该负载工艺具有良好的重现性。

3.6 通过高效液相色谱（HPLC）测定β-谷甾醇的载药量和包封率：BST在1.5–200 μg/mL范围内呈良好线性关系（R² = 0.9998），即使最低浓度也可被灵敏检出，证明BST被成功包载于纳米纤维。

3.7 体外药物释放：AgNPs呈快速释放行为，5 min时释放约60%，30 min内完全释放；BST在5 min时释放约15%，15 min时累积释放达33%，30 min时达100%。两种活性成分均在30 min内接近完全释放，并维持稳定状态至360 min。

3.8 抗菌最低抑菌浓度（MIC）：AgNPs与AgNPs + BST对金黄色葡萄球菌ATCC 29213和ATCC 43300的MIC均为62.5 μg/mL，对ATCC BAA-977为31.2 μg/mL；对铜绿假单胞菌ATCC 27853的MIC为31.2 μg/mL，对MDR-7067为15.6 μg/mL。BST单独在所有测试菌株及浓度下均未表现出生长抑制作用。

3.9 抑菌圈（ZOI）：载药纤维对三种金黄色葡萄球菌菌株及铜绿假单胞菌ATCC 27853的抑菌圈直径显著大于AgNPs单独圆盘与空白纤维；但在铜绿假单胞菌MDR 7067中未观察到显著差异。空白PVA/CS纤维亦表现出与AgNPs圆盘相当的抗菌效应，主要归因于CS本身固有的抗菌活性；而载药纤维进一步增强的抑菌效果则主要归功于AgNPs与BST的协同贡献。

3.10 体外细胞活力评估：通过MTS（3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑）法检测发现，AgNPs单独在24 h和48 h内对HFF1细胞无毒性浓度上限为15.6 μg/mL，72 h内为31.2 μg/mL；AgNPs + BST在24、48、72 h三个时间点内无毒性浓度上限均达31.2 μg/mL；BST单独在所有测试浓度下均不引起细胞活力下降，存活率维持在100%。

讨论部分中，研究人员指出，纳米纤维敷料可模拟细胞外基质结构，允许伤口部位气体交换并支持生物活性化合物的持续控释。PVA具有优良的水溶性、成纤性及机械性能，CS则赋予材料生物可降解性与生物相容性，并具备固有抗菌活性。尽管BST的促愈合特性已有文献报道，但其单独抗菌活性研究有限，且现有结论存在差异；本研究通过将其与AgNPs共载于纳米纤维，成功构建了具有增强抗菌性能的功能性递送体系。空白PVA/CS纤维表现出的抗菌效应主要源于CS，而载药纤维相对于空白纤维进一步强化的抗菌活性则主要归功于AgNPs与BST的协同作用及纳米纤维基质的控释效应。此外，AgNPs可通过破坏细菌细胞膜、干扰DNA/RNA复制与转录、抑制群体感应及穿透生物膜等多重机制发挥杀菌作用。值得注意的是，本研究的细胞相容性评估仅针对AgNPs与BST的单独或组合效应，而非完整纳米纤维构建体；抗菌能力也仅在体外条件下验证，尚未在真实伤口病理环境中测试，且BST对促进伤口愈合的独立贡献未能单独确证。

结论部分：本研究构建了一种新型PVA/CS/AgNPs/BST复合体系，该体系对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出优越的抗菌效果，作为加速伤口愈合的敷料具有重要应用潜力。然而，这些发现仍需通过实际伤口环境下的体内动物实验和人体研究加以进一步验证。